Nøkkelforskjell – PCR vs DNA-sekvensering
PCR og DNA-sekvensering er to viktige teknikker innen molekylærbiologi. Polymerase Chain Reaction (PCR) er prosessen som skaper et stort antall kopier av et DNA-fragment. DNA-sekvensering er teknikken som resulterer i den nøyaktige rekkefølgen av nukleotidene til et gitt DNA-fragment. Dette er nøkkelforskjellen mellom PCR og DNA-sekvensering. PCR er et av de viktigste trinnene involvert i DNA-sekvensering.
Hva er PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) er en DNA-amplifikasjonsteknikk som brukes i molekylærbiologi. Den produserer tusenvis til millioner av kopier av et bestemt DNA-fragment. Denne metoden ble utviklet av Kary Mullis i 1983. I denne teknikken tjener DNA-fragmentet som skal amplifiseres som mal, og DNA-polymerase-enzymet legger komplementære nukleotider til primeren som er tilgjengelig i PCR-blandingen. På slutten av PCR-reaksjonen syntetiseres mange kopier av DNA-prøven.
Det er forskjellige komponenter i PCR-blandingen, inkludert DNA, DNA-polymerase (Taq-polymerase), primere (forover- og reversprimere), nukleotider (byggesteiner av DNA) og en buffer. PCR skjer inne i en PCR-maskin, og riktig PCR-blanding skal lastes inn i maskinen, og riktig program skal kjøres. Denne teknikken muliggjør produksjon av tusenvis til millioner av kopier av en bestemt del av DNA fra en svært liten mengde DNA.
PCR-reaksjoner skjer på en syklisk måte for å produsere den synlige mengden PCR-produkter på en gel. Det er tre hovedtrinn involvert i en PCR-reaksjon, nemlig denaturering, primer-annealing og strengforlengelse som vist i figur 01. Disse tre trinnene skjer ved tre forskjellige temperaturer. DNA eksisterer i dobbelttrådet form ved hydrogenbindinger mellom de komplementære basene. Før implikasjon bør dobbelttrådet DNA separeres fra hverandre. Det gjøres ved å gi høy temperatur. Ved høy temperatur denatureres dobbelttrådet DNA til enkelttråder. Deretter bør primerne komme nærmere de flankerende endene av det spesifikke fragmentet eller genet til DNA. Primer er et kort stykke enkelttrådet DNA som er komplementært til målsekvensen. Forover- og reversprimere annealerer med de komplementære basene ved de flankerende endene av det denaturerte prøve-DNA ved annealingstemperaturen. Primere bør være varmebestandige. Når primere annealerer med prøve-DNA, initierer taq-polymerase-enzymet syntesen av de nye trådene ved å legge til nukleotider som er komplementære til mål-DNA. Taq-polymerase er et varmestabilt enzym isolert fra en termofil bakterie k alt Thermus aquaticus. PCR-buffer opprettholder de optimale forholdene for taq-polymerasevirkningen. Disse tre stadiene av PCR-reaksjoner gjentas for å produsere den nødvendige mengden PCR-produkt. Etter hver PCR-reaksjon dobles antallet av DNA-kopi. Derfor kan en eksponentiell amplifikasjon observeres i PCR. PCR-produkter kan observeres ved bruk av gelelektroforese og kan renses for videre studier.
Figur 01: Hovedtrinn i en PCR-reaksjon
PCR er et verdifullt verktøy innen medisinsk og biologisk forskning. PCR har en spesiell verdi innen rettsmedisin siden den kan forsterke DNA for studier fra de bittesmå prøvene fra kriminelle og lage rettsmedisinske DNA-profiler. PCR er mye brukt i mange områder innen molekylærbiologi, inkludert genotyping, genkloning, mutasjonsdeteksjon, DNA-sekvensering, DNA-mikromatriser og farskapstesting, etc.
Figur 02: Polymerase-kjedereaksjon
Hva er DNA-sekvensering?
DNA-sekvensering er bestemmelsen av en nøyaktig rekkefølge av nukleotidene – adenin, guanin, cytosin og tymin i et gitt DNA-fragment. Genetisk informasjon lagres i DNA-sekvensene ved å bruke riktig rekkefølge av nukleotidene. Derfor er det svært viktig å finne den nøyaktige rekkefølgen av nukleotidene i et DNA-fragment om strukturen og funksjonen til genene.
DNA-sekvenseringsprotokoll involverer forskjellige prosesser. Det første trinnet er isolering av interessert DNA eller genomisk DNA fra en organisme. Ved å bruke PCR (som beskrevet ovenfor), bør den ønskede regionen av DNA amplifiseres. Amplifisert PCR-produkt bør separeres ved gelelektroforese og renses. Amplifiserte fragmenter serveres som maler for sekvensering. Sekvensering kan gjøres enten etter Sanger-sekvensering eller sekvenseringsmetode med høy gjennomstrømning. Sanger-sekvensering krever kapillærelektroforese av resulterende DNA-fragmenter. Bestemmelse av riktig nukleotidrekkefølge kan gjøres ved manuell avlesning av autoradiografer eller ved bruk av automatiserte DNA-sekvensere.
Gensekvensering bidro til Human genom-prosjektet og la til rette for kartleggingen av det menneskelige genomet i 2003. I rettsmedisin, muliggjorde DNA-sekvensering identifikasjon av individer som viser unike DNA-sekvenser og identifiserer kriminelle. I medisin kan DNA-sekvensering brukes til å oppdage genene som er ansvarlige for genetiske og andre sykdommer, finne defekte gener og erstatte dem med korrekte gener. I landbruket brukes DNA-sekvenseringsinformasjon fra enkelte mikroorganismer for å produsere transgene avlinger med økonomisk ønskede egenskaper.
Figur 03: DNA-sekvensering
Hva er forskjellen mellom PCR og DNA-sekvensering?
PCR vs DNA-sekvensering |
|
| PCR-prosessen skaper tusenvis til millioner av kopier av det interesserte DNA-fragmentet. | DNA-sekvensering er prosessen med å bestemme den nøyaktige rekkefølgen av nukleotidene i et gitt DNA-fragment. |
| Utfall | |
| PCR lager tusenvis til millioner av kopier av et bestemt DNA-fragment | Dette resulterer i riktig rekkefølge av basene i et bestemt DNA-fragment. |
| Involvering av ddNTP-er | |
| PCR krever ikke ddNTP-er. Den bruker dNTP-er. | DNA-sekvensering krever ddNTP-er for å avslutte tråddannelsen. |
Sammendrag – PCR vs DNA-sekvensering
PCR og DNA-sekvensering er svært viktige verktøy innen mange områder av molekylærbiologi. Amplifisering av DNA-fragmentene gjøres ved PCR-teknikken mens den riktige rekkefølgen av nukleotidene til et DNA-fragment bestemmes av DNA-sekvenseringen. Dette er forskjellen mellom PCR og DNA-sekvensering.
