PCR vs sanntids-PCR
PCR eller polymerasekjedereaksjon er en revolusjonert oppdagelse innen moderne molekylærbiologi, som først ble utviklet av kjemikeren Kary Mullis i 1983. Den lar en enkelt sekvens i et komplekst DNA amplifiseres for analyse. Grunntanken med PCR er at to primere, som er komplementære til de motsatte trådene i en DNA-sekvens, er orientert mot hverandre; primerne produserer komplementære tråder, som hver inneholder den andre primeren. Derfor er resultatet en stor mengde av en sekvens som tilsvarer DNA som ligger mellom de to primerne. DNA-polymerase-enzym brukes til å utvide primerne i PCR. DNA-polymerase er et termostabilt enzym, og det har evnen til å overleve i høye temperaturer (94 til 95 °C) som brukes til denaturering av mal-DNA.
PCR involverer tre trinn, nemlig gjentatte runder med denaturering, annealing av primere og syntese av DNA. En thermocycler-maskin brukes til å utføre denne reaksjonen slik at den kan programmeres til å endre temperaturene raskt og nøyaktig. Anvendelser av PCR er kriminelle etterforskninger, DNA-fingeravtrykk, påvisning av patogener og analyse av DNA fra tidlige menneskearter.
Hva er konvensjonell PCR?
Det er tre hovedstadier av konvensjonell PCR, nemlig; DNA-amplifikasjonstrinn, separasjon av PCR, og påvisning av produkter. Separasjon av DNA-segmenter gjøres vanligvis ved agarosegelelektroforese. Produktene farges deretter med etheiduimbromid. Til slutt oppnås deteksjon ved visualisering av bånd på geler under UV-lys. De endelige resultatene av konvensjonell PCR er derfor ikke uttrykt som tall. Norm alt kan den konvensjonelle PCR-en bare oppdage én enkelt parameter.
Hva er sanntids PCR?
Sanntids PCR kan oppdage forsterkning av produkter, ettersom produktene syntetiseres. Med teknologiutviklingen har PCR blitt en svært populær teknikk, spesielt for påvisning og identifisering av bakterier i matvarer. Sanntids-PCR-en bruker et fluorescerende fargesystem og termosykler utstyrt med fluorescerende deteksjonsevne.
Hva er forskjellen mellom konvensjonell PCR og sanntids-PCR?
• Konvensjonell PCR er mer tidkrevende ettersom den bruker gelelektroforese for å analysere de amplifiserte PCR-produktene. Derimot er sanntids-PCR mindre tidkrevende ettersom den kan oppdage forsterkninger i de tidlige fasene av reaksjonen.
• Sanntids-PCR samler inn data i den eksponentielle vekstfasen av PCR, mens tradisjonell PCR samler inn data ved endepunktet av reaksjonen.
• Sluttpunktresultatene for den konvensjonelle PCR-en er kanskje ikke veldig presise, men resultatene av sanntids-PCR-en er veldig presise.
• Sanntids-PCR er mer følsom enn konvensjonell PCR.
• Konvensjonell PCR har svært dårlig oppløsning, mens PCR i sanntid kan oppdage svært små endringer på grunn av høy oppløsning.
• Sluttpunktdeteksjon av konvensjonell PCR har kort dynamisk rekkevidde, mens sanntids PCR-deteksjon har bredt dynamisk område.
• I motsetning til konvensjonell PCR, finnes automatiserte deteksjonsteknikker i sanntids PCR.
• Konvensjonell PCR er svært sofistikert og arbeidskrevende mer enn sanntids-PCR.
• I motsetning til sanntids-PCR, kan ikke konvensjonell PCR skille mellom døde og levende bakterier.
• Sanntids-PCR bruker fluorescerende fargesystem for å oppdage produktene, mens konvensjonell PCR bruker etidiumbromid og UV-lys for å visualisere bånd i agarosegelmediet.
