Nøkkelforskjell – PCR vs DNA-replikasjon
DNA-replikasjon er en naturlig prosess som skjer i levende organismer. Det innebærer produksjon av to identiske kopier av ett DNA-molekyl. DNA-replikasjon er en ekstremt viktig prosess for biologisk arv. Genetisk informasjon overføres fra foreldre til avkom hovedsakelig på grunn av evnen til DNA-replikasjon. Derfor er det en viktig prosess som forekommer i nesten alle levende organismer. Denne prosessen skjer in vivo. Imidlertid kan DNA-replikasjon også gjøres via in vitro-metoder. Polymerase Chain Reaction (PCR) er en slik in vitro-metode for DNA-replikasjon. PCR er en DNA-amplifikasjonsmetode utført i laboratorier. Den produserer tusenvis til millioner av kopier av DNA fra et interessert DNA-fragment eller et gen. Det er forskjeller mellom in vivo DNA-replikasjon og PCR. Hovedforskjellen mellom disse to er at PCR utføres i en PCR-maskin ved opprettholdt temperatur for å produsere et stort antall kopier av DNA, mens DNA-replikasjon skjer inne i kroppen ved kroppstemperatur for å produsere to identiske kopier av et enkelt DNA-molekyl.
Hva er PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) er en in vitro DNA-amplifikasjonsteknikk som rutinemessig utføres i molekylærbiologiske laboratorier. Denne metoden muliggjorde produksjon av tusenvis til millioner av kopier av et spesielt interessert DNA-fragment. PCR ble introdusert av Kary Mullis i 1980. I denne teknikken blir det interesserte fragmentet av DNA tjent som mal for å lage kopier. Enzymet k alt Taq-polymerase brukes som DNA-polymerase-enzymet, og det vil katalysere syntesen av nye tråder av DNA-fragmentet. Primere som er i PCR-blandingen vil fungere som utgangspunkt for fragmentforlengelsene. Ved slutten av PCR-reaksjonen kan mange kopier av DNA-prøven fås.
Alle ingrediensene som er nødvendige for å lage kopier av DNA er inkludert i PCR-blandingen. De er prøve-DNA, DNA-polymerase (Taq-polymerase), primere (forover- og reversprimere), nukleotider (byggesteiner av DNA) og en buffer. PCR-reaksjon kjøres i en PCR-maskin, og den skal mates med riktig PCR-blanding og riktig PCR-program. Hvis reaksjonsblandingen og programmet er riktig, vil det produsere den nødvendige mengden kopier av en bestemt del av DNA fra en svært liten mengde DNA.
Det er tre hovedtrinn involvert i en PCR-reaksjon, nemlig denaturering, primer-annealing og strengforlengelse. Disse tre trinnene skjer ved tre forskjellige temperaturer. DNA eksisterer som en dobbelttrådet helix. To tråder er bundet med hydrogenbindinger. Før amplifikasjon separeres dobbelttrådet DNA ved å gi høy temperatur. Ved høy temperatur denatureres dobbelttrådet DNA til enkelttråder. Deretter annealer primerne med de flankerende endene av det interesserte fragmentet eller genet til DNA. Primer er et kort stykke enkelttrådet DNA som er komplementært til endene av målsekvensen. Forover- og reversprimere annealerer med de komplementære basene ved de flankerende endene av det denaturerte prøve-DNA-et ved annealingstemperaturen.
Når primere anneales med DNA, initierer Taq-polymerase-enzymet syntesen av de nye trådene ved å legge til nukleotider som er komplementære til mal-DNA. Taq polymerase er et varmestabilt enzym som er isolert fra en termofil bakterie k alt Thermus aquaticus. PCR-buffer opprettholder de optimale forholdene for Taq-polymerasevirkningen. Disse tre stadiene av PCR-reaksjonen gjentas for å produsere den nødvendige mengden av PCR-produktet. Ved hver PCR-reaksjon dobles antallet av DNA-kopi. Derfor kan en eksponentiell amplifikasjon observeres i PCR. PCR-produkt kan observeres ved bruk av gelelektroforese siden det produserer den synlige mengden DNA på en gel og det kan renses for videre studier som sekvensering osv.
Figur 01: PCR
PCR er et verdifullt verktøy innen medisinsk og biologisk forskning. Spesielt i rettsmedisinske studier har PCR en enorm verdi siden den kan forsterke DNA for studier fra de små prøvene av kriminelle og lage rettsmedisinske DNA-profiler. PCR er mye brukt i mange områder av molekylærbiologien, inkludert genotyping, genkloning, mutasjonsdeteksjon, DNA-sekvensering, DNA-mikroarrayer og farskapstesting osv.
Hva er DNA-replikasjon?
DNA-replikasjon refereres til prosessen som produserer to identiske kopier av DNA fra ett DNA-molekyl. Det er en viktig prosess for biologisk arv. DNA-replikasjon forekommer i alle levende organismer. Genomet til foreldrecellen bør replikeres for å overlevere genomet til dattercellen. DNA-replikasjonsprosessen har tre hovedtrinn k alt initiering, forlengelse og terminering. Disse trinnene katalyseres av forskjellige enzymer. DNA-replikasjon starter fra stedet som kalles replikasjonsopprinnelse i cellenes genom. I genomet eksisterer DNA i dobbelttrådet form. Disse to trådene separeres i begynnelsen av DNA-replikasjonen, og det gjøres av ATP-avhengig DNA-helikase. Avviklingen av DNA er hovedhendelsen som skjer i initieringstrinnet. Ved å bruke separerte DNA-tråder som maler, syntetiserer DNA-polymerase de nye komplementære trådene til malstrengene i 5' til 3' retning. Dette er trinnet som kalles forlengelse. Avslutning skjer når de to replikasjonsgaflene møtes med hverandre på motsatt ende av foreldrekromosomet.
Figur 02: DNA-replikasjon
Bortsett fra DNA-polymerase er flere enzymer som DNA-primase, DNA-helikase, DNA-ligase og Topoisomerase involvert i DNA-replikasjonen. Et spesielt trekk ved in vivo DNA-replikasjonen er at den produserer Okazaki-fragmenter. Den ene tråden formes kontinuerlig mens den andre dannes i små biter.
Hva er likhetene mellom PCR og DNA-replikasjon?
- I både PCR- og DNA-replikasjon separeres dobbelttrådet DNA fra hverandre.
- I både PCR- og DNA-replikasjonsprosesser kopieres DNA.
- Både PCR- og DNA-replikasjonsprosesser er veldig viktige.
- I både PCR- og DNA-replikasjonsprosesser er DNA-polymeraseenzym involvert.
Hva er forskjellen mellom PCR og DNA-replikasjon?
PCR vs DNA-replikering |
|
| PCR er en in vitro-metode for DNA-amplifisering der tusenvis til millioner av kopier av DNA produseres. | DNA-replikasjon er en naturlig prosess som produserer to identiske kopier av DNA fra ett DNA-molekyl. |
| Steps | |
| PCR har tre trinn; denaturering, primer-annealing og strengforlengelse. | DNA-replikering har tre trinn; initiering, forlengelse og avslutning. |
| Involvement of Primers | |
| PCR trenger kunstige primere. | DNA-replikasjon trenger ikke kunstige primere. Et kort fragment av RNA er involvert i DNA-replikasjon. |
| Denaturering av dobbeltstrengene | |
| Dobbeltråder skilles ved å bruke høy temperatur i PCR. | Dobbeltråder separeres fra hverandre av enzymet DNA-helikase i DNA-replikasjon. |
| Enzyme Involved | |
| PCR bruker Taq-polymerase. | DNA-replikering bruker DNA-polymerase. |
| Temperature | |
| PCR forekommer ved tre forskjellige temperaturer inne i en maskin. | DNA-replikasjon skjer ved kroppstemperatur i kroppen til den levende organismen. |
| In vivo eller In vitro | |
| PCR er en in vitro-metode. | DNA-replikering er en in vivo-metode. |
Sammendrag – PCR vs DNA-replikasjon
DNA-replikasjon er en prosess for å produsere to identiske kopier av DNA fra et enkelt DNA-molekyl. Det forekommer i alle levende organismer siden det tilbyr en metode for å gi genetisk informasjon fra foreldre til avkom. Den består av tre enzymatisk katalyserte trinn, nemlig initiering, forlengelse og terminering. DNA-replikasjon kan gjøres kunstig i laboratoriet. PCR er en måte å produsere et stort antall kopier av DNA fra det interesserte DNA. PCR utføres rutinemessig i molekylærbiologiske laboratorier siden det er en enkel metode for å produsere kopier av DNA. Dette er forskjellen mellom PCR og DNA-replikasjon.
