Nøkkelforskjell – Genkloning vs PCR
Syntesen av mange kopier av DNA fra et spesifikt DNA-fragment kalles DNA-amplifikasjon. Det er to hoved-DNA-amplifikasjonsprosesser, nemlig genkloning og PCR. Den viktigste forskjellen mellom genkloning og PCR er at genkloning produserer flere kopier av et spesifikt gen in vivo ved å konstruere et rekombinant DNA og vokse inne i en vertsbakterie mens PCR produserer millioner av kopier av et spesifikt DNA-fragment in vitro som gjennomgår gjentatte sykluser av denaturering og syntese.
Hva er genkloning?
Genkloning er en teknikk som brukes for å lokalisere og multiplisere et spesifikt gen fra det ekstraherte genomiske DNAet til en organisme gjennom konstruksjon av rekombinant DNA. Genomisk DNA inneholder tusenvis av forskjellige gener kodet for proteiner. Når DNA ekstraheres, inkluderer det alle mulige gener det kan bære. Genkloningsteknikk har muliggjort deteksjon av et spesifikt gen fra det totale DNA. Derfor fungerer genkloning som et viktig verktøy innen molekylærbiologi.
Å lage et genomisk bibliotek av en organisme er essensielt i genkloning hvis det ikke er noen anelse om plasseringen av det aktuelle genet i DNA. Et genomisk bibliotek lages ved å bruke følgende trinn.
Trinn 1: Ekstraksjon av det totale DNA fra en organisme som inneholder det ønskede genet.
Trinn 2: Restriksjonsfordøyelse av det ekstraherte DNAet for å produsere små håndterbare fragmenter. Dette trinnet forenkles av restriksjonsendonukleaser.
Trinn 3: Valg av en passende vektor og åpning av vektor-DNA ved bruk av de samme restriksjonsendonukleasene. Bakterieplasmider brukes ofte som vektorer for å bære fremmed DNA. Plasmider er små sirkler av DNA lokalisert i bakterier.
Trinn 4: Kombinering av vektor-DNA og fragmentert DNA for å produsere rekombinant DNA-molekyl. Dette trinnet styres av DNA-ligase.
Trinn 5: Overføring av rekombinante DNA-molekyler til vertsbakterier. Dette trinnet er kjent som transformasjon, og gjøres ved hjelp av et varmesjokk.
Trinn 5: Screening av transformerte bakterieceller på et kulturmedium. En blandet populasjon av transformerte og ikke-transformerte vertsceller oppnås ved slutten av transformasjonsprosessen. Som gen av interesse inkluderer bare i transformerte vertsceller. Derfor er det nødvendig å velge transformerte celler. Utvalget gjøres ved hjelp av selektive medier som inneholder antibiotika. Bare de transformerte cellene vokser på dette screeningsmediet som muliggjør seleksjonen.
Trinn 6: Dyrking av bakterier for å produsere et genbibliotek. I dette trinnet blir de transformerte vertscellene introdusert i ferske kulturmedier som gir optimale vekstkrav. Totale kolonier på kulturplatene representerer det genomiske biblioteket til den organismen.
Trinn 7: Det rekombinante DNA-molekylet som inneholder genet av interesse, må screenes fra tusenvis av klonede fragmenter av rekombinant DNA. Det kan oppnås ved bruk av prober som markerer det spesifikke genet eller det spesifikke proteinresultatet fra det genet.
Når det interesserte genet som inneholder bakteriekolonien er identifisert fra de totale koloniene, er det mulig å lage millioner av kopier av det rekombinante plasmidet som inneholder genet.
Genkloning brukes til å etablere genbiblioteker, produsere spesialprotein, vitaminer, antibiotika, hormoner, sekvensere og kartlegge genomer av organismer, lage flere kopier av individers DNA i rettsmedisin osv.
Figure_1: Genkloning
Hva er PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) er en teknikk som genererer et stort antall kopier av et bestemt DNA-fragment. Eksponentiell amplifikasjon av en spesifikk DNA-sekvens oppnås ved PCR under in vitro-betingelser. Denne teknikken er et veldig kraftig verktøy innen molekylærbiologi siden den kan multiplisere en liten prøve av DNA til en brukbar mengde. PCR ble introdusert av Kary Mullis i 1983, og denne prisvinnende oppfinnelsen skapte et stort fremskritt innen molekylærbiologi.
PCR-teknikk følger gjentatte PCR-reaksjoner som vist i figur 02. En PCR-reaksjon består av tre hovedtrinn som skjer ved tre forskjellige temperaturer; denaturering av dobbelttrådet ved DNA ved 94 0C, annealing av primere ved 68 0C og trådforlengelse ved 72 0 C. Derfor, når PCR utføres, bør temperatursvingninger opprettholdes for riktig replikasjon. PCR utføres i en PCR-maskin inne i PCR-rør. PCR-rør er lastet med korrekte PCR-blandinger som inneholder mal-DNA, Taq-polymerase, primere, dNTP-er og buffer. Denaturering av dobbelttrådet prøve-DNA til enkelttrådet DNA gjøres ved å bryte hydrogenbindingene mellom komplementære baser ved 94 – 98 0C. Deretter blir enkeltstrenger av mal-DNA eksponert for primere. Et par primere (forover og bakover) bør leveres, og de bør være termostabile for å tåle høye temperaturer. Primere er enkelttrådede korte DNA-sekvenser som er komplementære til endene av mål-DNA-fragmentet. Syntetiske primere brukes i PCR. Primere binder seg til de komplementære basene til prøve-DNA og starter syntesen av en ny tråd. Dette trinnet katalyseres av et enzym k alt Taq polymerase; et termostabilt DNA-polymerase-enzym isolert fra Thermus auqaticus. Når primere og nukleotider (byggesteiner) er tilgjengelige, konstruerer Taq-polymerase den nye DNA-strengen som er komplementær til mal-DNA. På slutten av PCR-programmet observeres amplifisert DNA-fragment ved bruk av gelelektroforese. Hvis ytterligere analyse er nødvendig, renses PCR-produktet fra gelen.
PCR er svært nyttig for diagnostisering og overvåking av genetiske og ervervede sykdommer, identifisering av kriminelle (i feltet rettsmedisin), studere strukturen og funksjonen til et målrettet segment av DNA, sekvensering og kartlegging av genomer til organismer, etc. PCR har blitt en rutinemessig laboratorieteknikk i medisinske og molekylærbiologiske forskningslaboratorier blant forskere siden den har en lang rekke bruksområder.
Figure_2: Polymerase-kjedereaksjon
Hva er forskjellen mellom genkloning og PCR?
Genkloning vs PCR |
|
| Genkloning er prosessen med å lage flere kopier av et spesifikt gen in vivo gjennom rekombinant DNA og transformere til en vertsbakterie. | PCR-teknikken produserer flere kopier av en bestemt DNA-sekvens in vitro gjennom gjentatte sykluser med PCR-reaksjoner. |
| Krav for å konstruere rekombinant DNA | |
| Rekombinant DNA produseres for å lokalisere genet. | Rekombinant DNA produseres ikke. |
| Need of Labour | |
| Denne prosessen er arbeidskrevende. | Intensiv arbeidskraft er ikke nødvendig. |
| In vivo eller in vitro prosess | |
| Konstruksjon av rekombinant DNA er in vitro og amplifikasjonen av DNA er in vivo. | Amplifikasjonen av DNA skjer fullstendig in vitro. |
Sammendrag – Genkloning vs PCR
Genkloning og PCR er to metoder som brukes for DNA-amplifisering. PCR er en in vitro prosess som lager flere kopier av DNA av et bestemt DNA-fragment uten å bruke rekombinant DNA og en vertsorganisme. Genkloning er først og fremst en in vivo prosess som resulterer i flere kopier av et interessert gen inne i vertsorganismen via konstruksjon av rekombinant DNA. Dette er forskjellen mellom genkloning og PCR.
