Nøkkelforskjellen mellom konvensjonelle nestede og sanntids PCR-analyser er at konvensjonell PCR er en teknikk utviklet for å amplifisere spesifikke sekvenser av DNA og nestet PCR er en modifikasjon av konvensjonell PCR som består av to sekvensielle amplifikasjonsreaksjoner, mens ekte -time PCR er en variant av konvensjonell PCR som er i stand til å kvantifisere det amplifiserte produktet.
PCR er en svært vanlig vitenskapelig teknikk som er mye brukt i forskning og medisin for å oppdage DNA. PCR-tester brukes til å påvise antigener ved å påvise deres DNA eller RNA. Vanligvis er vir alt RNA tilstede i kroppen før det oppdages antistoffer eller viser symptomene på sykdommen. En PCR-test kan fortelle om noen har viruset tidlig eller ikke. Foreløpig er PCR standardtesten for å oppdage COVID-19 sykdom. Det finnes forskjellige typer PCR-teknikker som sanntids PCR, nestet PCR, multipleks PCR, varmstart PCR og langdistanse PCR osv.
Hva er konvensjonelle PCR-analyser?
Konvensjonell PCR-analyse er en in vitro DNA-amplifikasjonsteknikk som rutinemessig utføres i molekylærbiologiske laboratorier. Denne metoden muliggjorde produksjon av tusenvis til millioner av kopier av et bestemt DNA-fragment. Kary Mullis introduserte denne teknikken i 1980. Denne teknikken krever et DNA-fragment kjent som malen for å lage mange kopier av den. Taq-polymerase fungerer som DNA-polymerase-enzymet og katalyserer syntesen av nye tråder i malsekvensen.
Primere i PCR-blandingen vil fungere som utgangspunkt for fragmentforlengelsene. Alle ingrediensene som er nødvendige for å lage kopier av DNA er inkludert i PCR-blandingen. PCR-reaksjon kjøres i en PCR-maskin, og den skal mates med riktig PCR-blanding og riktig PCR-program. Hvis reaksjonsblandingen og programmet er riktig, vil det produsere det nødvendige antallet kopier av en bestemt del av DNA fra en svært liten mengde DNA.
Figur 01: Konvensjonell PCR-analyse
Det er tre hovedtrinn involvert i en PCR-reaksjon: denaturering, primer-annealing og strengforlengelse. Disse tre trinnene skjer ved tre forskjellige temperaturer. PCR-buffer opprettholder de optimale forholdene for Taq-polymerasevirkningen. Disse tre stadiene av PCR-reaksjonen gjentas for å produsere den nødvendige mengden av PCR-produktet. Ved hver PCR-reaksjon dobles antallet DNA-kopier. Derfor kan eksponentiell amplifikasjon observeres i PCR. PCR-produkt kan løses ved hjelp av gelelektroforese siden det produserer en synlig mengde DNA på en gel, og det kan renses for videre studier som sekvensering.
PCR er et verdifullt verktøy innen medisinsk og biologisk forskning. Spesielt i rettsmedisinske studier har PCR en enorm verdi siden den kan forsterke DNA for studier fra de små prøvene av kriminelle og lage rettsmedisinske DNA-profiler. PCR er mye brukt i mange områder av molekylærbiologi, inkludert genotyping, genkloning, mutasjonsdeteksjon, DNA-sekvensering, DNA-mikroarrayer og farskapstesting.
Hva er Nested PCR-analyser?
Nested PCR er en type PCR som reduserer den uspesifikke amplifikasjonen av DNA. Det er to påfølgende PCR-er eller to sekvensielle amplifikasjonsreaksjoner i nestet PCR-analyse. Under den første amplifikasjonsreaksjonen produseres et PCR-produkt. Etter den første reaksjonen utføres en andre amplifikasjonsreaksjon på PCR-produktet fra den første reaksjonen. Derfor binder primere i den andre reaksjonsblandingen til det første PCR-produktet og amplifiserer det.
Figur 02: Nestet PCR
Primer-par er forskjellige i hver reaksjon. Den ikke-spesifikke bindingen av primere reduseres i nestet PCR. Nestede PCR-analyser er nyttige for å øke sensitiviteten og/eller spesifisiteten. Nestet PCR krever imidlertid kunnskap om den interesserte sekvensen.
Hva er sanntids PCR-analyser?
Sanntids PCR eller kvantitativ PCR (Q PCR) er en modifisert versjon av PCR som måler PCR-produktene kvantitativt. Derfor kvantifiserer denne teknikken amplifikasjonen i sanntid ved bruk av en sanntids PCR-maskin. Det er også en egnet metode for å bestemme mengden av en målsekvens eller gen som er tilstede i en prøve.
Det interessante med sanntids PCR er at den kombinerer både forsterkning og sann kvantifisering i ett enkelt trinn. Derfor kan behovet for gelelektroforese for deteksjon elimineres ved sanntids PCR-teknikk. Bruk av fluorescerende fargestoffer for å merke PCR-produkter under PCR-reaksjonene vil til slutt føre til direkte kvantifisering. Når PCR-produktene akkumuleres, akkumuleres også de fluorescerende signalene, og de vil bli målt av sanntidsmaskinen. SYBR Green og Taqman er to metoder for å oppdage eller se forsterkningsprosessen til sanntids PCR. Begge metodene overvåker fremdriften i forsterkningsprosessen og rapporterer mengden av produktet i sanntid.
Figur 03: PCR i sanntid
Sanntids-PCR har en lang rekke bruksområder som kvantifisering av genuttrykk, mikroRNA og ikke-kodende RNA-analyse, SNP-genotyping, påvisning av kopinummervarianter, påvisning av sjeldne mutasjoner, påvisning av genmodifiserte organismer, og påvisning av smittestoffer.
Hva er likhetene mellom konvensjonelle nestede og sanntids PCR-analyser?
- Nestede og sanntids PCR-analyser er modifikasjoner av konvensjonelle PCR-analyser.
- Alle tre teknikkene forsterker DNA-prøver.
- Produktene deres kan brukes i sekvensering eller analyse.
- Disse analysene krever primere.
Hva er forskjellen mellom konvensjonelle nestede og sanntids PCR-analyser?
Konvensjonell PCR er en teknikk utviklet for å amplifisere spesifikke DNA-sekvenser. I mellomtiden er Nested PCR en modifikasjon av konvensjonell PCR som består av to sekvensielle amplifikasjonsreaksjoner, og sanntids PCR er en variant av konvensjonell PCR som er i stand til å kvantifisere det amplifiserte produktet. Så dette er nøkkelforskjellen mellom konvensjonelle nestede og sanntids PCR-analyser. I motsetning til konvensjonell og sanntids PCR, bruker nestet PCR to primersett. Dessuten er det to påfølgende amplifikasjonsreaksjoner i nestet PCR for å redusere ikke-spesifikk amplifikasjon. dessuten inneholder ikke de konvensjonelle og sanntids PCR-analysene to sekvensielle amplifikasjonsreaksjoner.
Følgende infografikk viser forskjellene mellom konvensjonelle nestede og sanntids PCR-analyser i tabellform for side ved side-sammenligning.
Sammendrag – konvensjonelle vs nestede vs sanntids PCR-analyser
Konvensjonell PCR er den første teknikken utviklet for å amplifisere spesifikke fragmenter av DNA. Nested PCR og sanntids PCR er to varianter av konvensjonell PCR. Det er to sekvensielle amplifikasjonsreaksjoner og bruk av to primersett i nestet PCR. Sanntids-PCR er utviklet for å kvantifisere det amplifiserte PCR-produktet. Dermed oppsummerer dette forskjellen mellom konvensjonelle nestede og sanntids PCR-analyser.
