Key Difference – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nukleotider er de grunnleggende strukturelle enhetene og byggesteinene i DNA. DNA-molekylet er sammensatt av en polynukleotidkjede. Det finnes fire forskjellige nukleotider i DNA. Disse nukleotidene er sammensatt av fire forskjellige nitrogenholdige baser k alt A (adenin), G (guanin), C (cytosin), T (tymin). Rekkefølgen på nukleotidene i DNA-molekylet har stor betydning da det koder for en viktig genetisk informasjon for organismers vekst og utvikling. DNA-sekvensering refererer til prosessen som bestemmer den nøyaktige nukleotidsekvensen til DNA. Det finnes forskjellige DNA-sekvenseringsmetoder. Maxam Gilbert-sekvensering og Sanger DNA-sekvensering er to metoder for DNA-sekvensering som tilhører første generasjons sekvensering. Maxam Gilbert sekvenseringsprosedyre bestemmer basesekvensen ved kjemisk å sp alte de 5'-endemerkede DNA-fragmentene fortrinnsvis ved hver av fire nukleotider og gelelektroforese. Sanger-sekvenseringsprosedyren bestemmer nukleotidsekvensen ved å syntetisere enkelttrådet DNA ved bruk av DNA-polymerase og dideoksynukleotider og gelelektroforese. Dette er hovedforskjellen mellom Maxam Gilbert og Sanger Sequencing.
Hva er Maxam Gilbert-sekvensering?
Maxam Gilbert-sekvensering, også kjent som kjemisk sekvenseringsmetode, er en teknikk som ble utviklet for å bestemme rekkefølgen av nukleotidene i DNA. Denne metoden ble introdusert av W alter Gilbert og Alan Maxam i 1976 og ble populær siden den kan utføres direkte med renset DNA. Maxam Gilbert-metoden tilhører den første generasjonen av DNA-sekvensering, og det var den første sekvenseringsmetoden som ble brukt mye av forskere.
Det grunnleggende prinsippet for denne metoden ligger i restriksjonen av de endemerkede DNA-fragmentene ved spesifikke baser ved basespesifikke kjemikalier og betingelser og separering av de merkede fragmentene ved elektroforese som vist i figur 01. Fragmenter separeres iht. til deres størrelser på gelen. Siden fragmentene er merket, kan sekvensen til DNA-molekylet lett utledes.
Maxam gilbert-metoden bruker basespesifikke kjemikalier for å bryte DNA ved spesifikke baser. To vanlige kjemikalier k alt dimetylsulfat og hydrazinkjemikalier brukes til å selektivt angripe henholdsvis puriner og pyrimidiner.
Maxam Gilbert-sekvenseringsmetoden utføres via flere trinn som følger.
- Rensing av DNA-sekvensen ved bruk av restriksjonsendonukleaser
- Merking av endene av DNA-fragmentene ved å tilsette radioaktive fosfater
- Rensing av de merkede fragmentene fra ikke-merkede fragmenter ved gelelektroforese
- Separering av endemerket DNA i fire rør og behandling med basespesifikke kjemikalier separat
- Elektroforese av innholdet i hvert rør på separate linjer på en gel og fragmentseparasjon i henhold til deres lengde.
- Deteksjon av fragmentene med autoradiograf.
Figur 01: Maxam Gilbert Sequencing
Hva er Sanger Sequencing?
Sanger Sequencing er en sekvenseringsmetode utviklet av Frederick Sanger og hans kolleger i 1977 for å bestemme basesekvensen til et gitt DNA-fragment. Det er også kjent som kjedetermineringssekvensering eller Dideoxy-sekvenseringsmetode. Denne metoden fungerer etter prinsippet om selektiv inkorporering av kjedeterminerende dideoksynukleotider (ddNTPs) som ddGTP, ddCTP, ddATP og ddTTP av DNA-polymerase under syntesen av enkelttrådet DNA for å terminere dannelse av tråder. Dideoksynukleotider mangler 3' OH-grupper for dannelse av fosfodiesterbindinger med tilstøtende nukleotid. Derfor stopper strengdannelsen når en ddNTP er inkorporert i nydannende streng under sanger-sekvensering.
I denne metoden utføres fire separate DNA-syntesereaksjoner (PCR) i fire separate rør med én type ddNTP. Det stilles også andre krav til rørene for PCR inkludert primere, dNTP, Taq polymerase, spesifikke forhold osv. Fire separate reaksjoner utføres i fire rør med fire blandinger. Etter PCR-reaksjoner blir resulterende DNA-fragmenter varmedenaturert og separert ved gelelektroforese. Deretter blir fragmentene visualisert ved å bruke enten en merket (radioaktiv eller fluorescerende) primer eller dNTP-er som vist i figur 02.
Figur 02: Sanger Sequencing
Hva er forskjellen mellom Maxam Gilbert og Sanger Sequencing?
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Maxam Gilbert-sekvensering er den første teknikken utviklet for DNA-sekvensering. | Sanger-sekvenseringsmetoden ble introdusert etter Maxam Gilbert-sekvenseringsmetoden. |
| Usage | |
| Denne metoden brukes sjelden. | Sanger-sekvensering brukes rutinemessig til sekvensering. |
| Bruk av farlige kjemikalier | |
| Den bruker farlige kjemikalier. | Bruk av farlige kjemikalier er begrenset sammenlignet med Maxam Gilbert-metoden. |
| Merking for deteksjon | |
| Denne metoden bruker radioaktiv P32 for å merke endene av DNA-fragmentene. | Sanger-sekvensering bruker radioaktivt eller fluorescerende merkede ddNTP-er. |
Summary – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxam Gilbert og Sanger-sekvensering er to typer DNA-sekvenseringsteknikker som kommer under første generasjons DNA-sekvensering. Maxam Gilbert-sekvensering er den første metoden som ble introdusert for DNA-sekvensering i 1976, og den utføres ved å bryte de endemerkede DNA-fragmentene med basespesifikke kjemikalier. Derfor er det kjent som kjemisk sekvensering. Sanger-sekvenseringsmetoden ble introdusert i 1977, og er basert på de ddNTP-drevne kjedetermineringsreaksjonene. Sanger-sekvenseringsmetode populær enn Maxam Gilbert-metoden på grunn av flere ulemper ved Maxam Gilbert-metoden som for mye tidsforbruk, bruk av farlige kjemikalier, etc. Dette er forskjellen mellom Maxam Gilbert og Sanger-sekvensering.
