Key Difference – NGS vs Sanger Sequencing
Next Generation Sequencing (NGS) og Sanger Sequencing er to typer nukleotidsekvenseringsteknikker utviklet over tid. Sanger Sequencing-metoden ble mye brukt i mange år og NGS erstattet den nylig på grunn av dens fordeler. Nøkkelforskjellen mellom NGS og Sanger Sequencing er at NGS fungerer etter prinsippet om å sekvensere millioner av sekvenser samtidig på en rask måte gjennom et sekvenseringssystem, mens Sanger Sequencing fungerer på prinsippet om kjedeterminering på grunn av selektiv inkorporering av dideoksynukleotider av DNA-polymeraseenzym under DNA-replikasjonen og resulterende fragmentseparasjon ved kapillærelektroforese.
Hva er nukleotidsekvensering?
Genetisk informasjon lagres i nukleotidsekvensene til DNA eller RNA til en organisme. Prosessen med å bestemme riktig rekkefølge av nukleotider (ved hjelp av fire baser) i et gitt fragment (i et gen, klynge av gener, kromosom og komplett genom) er kjent som nukleotidsekvensering. Det er svært viktig i genomiske studier, rettsmedisinske studier, virologi, biologisk systematikk, medisinsk diagnose, bioteknologi og på mange andre felt å analysere strukturen og funksjonen til gener. Det finnes ulike typer sekvenseringsmetoder utviklet av forskere. Blant dem ble Sanger-sekvensering utviklet av Frederick Sanger i 1977 mye brukt og populært i en lang periode inntil Next Generation Sequencing erstattet den.
Hva er NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) er et begrep som brukes for å referere til moderne høykapasitets sekvenseringsprosesser. Den beskriver en rekke forskjellige moderne sekvenseringsteknologier som revolusjonerte genomiske studier og molekylærbiologi. Disse teknikkene er Illumina-sekvensering, Roche 454-sekvensering, Ion Proton-sekvensering og SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection) sekvensering. NGS-systemer er raskere og billigere. Fire hovedmetoder for DNA-sekvensering brukes i NGS-systemer, nemlig; pyrosekvensering, sekvensering ved syntese, sekvensering ved ligering og ionehalvledersekvensering. Et stort antall DNA- eller RNA-tråder (millioner av) kan sekvenseres parallelt. Den tillater sekvensering av hele genomet til organismer innen en kort tidsperiode, i motsetning til Sanger-sekvensering som tar mer tid.
NGS har mange fordeler i forhold til konvensjonell Sanger-metode. Det er en høyhastighets, mer nøyaktig og kostnadseffektiv prosess som kan utføres med en liten prøvestørrelse. NGS kan brukes i metagenomiske studier, ved påvisning av variasjoner innenfor et enkelt genom på grunn av insersjoner og delesjoner etc. og i analyse av genuttrykk.
Figure_1: Utviklinger i NGS-sekvensering
Hva er Sanger Sequencing?
Sanger Sequencing er en sekvenseringsmetode utviklet av Frederick Sanger og hans kolleger i 1977 for å bestemme den nøyaktige nukleotidrekkefølgen til et gitt DNA-fragment. Det er også kjent som kjedetermineringssekvensering eller Dideoxy-sekvensering. Arbeidsprinsippet for denne metoden er terminering av trådsyntese ved selektiv inkorporering av en kjedeterminerende dideoksynukleotider (ddNTPs) slik som ddGTP, ddCTP, ddATP og ddTTP av DNA-polymerase under replikering av DNA. Normale nukleotider har 3' OH-grupper for dannelse av en fosfodiesterbinding mellom tilstøtende nukleotider for å fortsette tråddannelsen. Imidlertid mangler ddNTP-er denne 3' OH-gruppen og er ikke i stand til å danne fosfodiesterbindinger mellom nukleotider. Derfor opphører kjedeforlengelsen.
I denne metoden fungerer enkelttrådet DNA som skal sekvenseres som malstreng for in vitro DNA-syntese. Andre krav er oligonukleotidprimer, deoksynukleotidforløpere og DNA-polymeraseenzym. Når de flankerende endene av målfragmentet er kjent, kan primere enkelt utformes for DNA-replikasjon. Fire separate DNA-syntesereaksjoner utføres i fire separate rør. Hvert rør har separate ddNTP-er, sammen med andre krav. Fra det aktuelle nukleotidet tilsettes en blanding av dNTP-er og ddNTP-er. Likeledes utføres fire separate reaksjoner i fire rør med fire blandinger. Etter reaksjonene utføres påvisning av DNA-fragmenter og konvertering av fragmentmønsteret til sekvensinformasjon. Resulterende DNA-fragmenter varmedenatureres og separeres ved gelelektroforese. Hvis radioaktive nukleotider brukes, kan båndmønsteret i polyakrylamidgelen visualiseres ved autoradiografi. Når denne metoden bruker de fluorescerende merkede dideoksynukleotidene, kan den reduseres nedover gelen som leses og føres gjennom en laserstråle for å bli oppdaget av fluorescensdetektoren. For å unngå feil som kan oppstå når en sekvens leses av øyet og legges inn manuelt i en datamaskin, utviklet denne metoden seg til bruk av automatisert sekvenser kombinert med datamaskinen.
Dette er metoden som brukes til å sekvensere DNA fra Human Genome-prosjektet. Denne metoden er fortsatt i bruk med avanserte modifikasjoner fordi den gir nøyaktig sekvensinformasjon til tross for at den er en kostbar og langsom prosess.
Figure_2: Sanger Sequencing
Hva er forskjellen mellom NGS og Sanger Sequencing?
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) refererer til moderne høykapasitets sekvenseringsprosesser. Den beskriver en rekke forskjellige moderne sekvenseringsteknologier | Sanger Sequencing er en sekvenseringsmetode utviklet av Frederick Sanger for å bestemme den nøyaktige nukleotidrekkefølgen til et gitt DNA-fragment. |
| Kostnadseffektivitet | |
| NGS er en billigere prosess fordi den reduserer tid, arbeidskraft og kjemikalier. | Dette er en kostbar prosess fordi det tar tid, arbeidskraft og flere kjemikalier. |
| Speed | |
| Dette er raskere siden både kjemisk deteksjon og signaldeteksjon av mange tråder skjer parallelt. | Dette er tidkrevende siden kjemisk deteksjon og signaldeteksjon skjer som to separate prosesser og bare på tråd kan lese om gangen. |
| Reliability | |
| NGS er pålitelig. | Sanger-sekvensering er mindre pålitelig |
| Sample Size | |
| NGS krever mindre mengde DNA. | Denne metoden trenger en stor mengde mal-DNA. |
| DNA-baser per sekvensert fragment | |
| Antallet DNA-baser per sekvensert fragment er lavere enn Sanger-metoden | Genererende sekvenser er lengre enn NGS-sekvenser. |
Summary – NGS vs Sanger Sequencing
NGS og Sanger-sekvensering er nukleotidsekvenseringsteknikker som er mye brukt i molekylærbiologi. Sanger-sekvensering er en tidlig sekvenseringsmetode som ble erstattet av NGS. Hovedforskjellen mellom NGS og Sanger Sequencing er at NGS er en høyhastighets, mer nøyaktig og kostnadseffektiv prosess enn Sanger-sekvensering. Begge teknikkene skapte store utbrudd innen genetikk og bioteknologi.
