Key Difference – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
DNA-sekvensering er svært viktig for DNA-analyse siden kunnskap om riktig nukleotidarrangement på en bestemt DNA-region avslører mye viktig informasjon om det. Det finnes forskjellige DNA-sekvenseringsmetoder. Sanger-sekvensering og Pyrosequencing er to forskjellige DNA-sekvenseringsmetoder som er mye brukt i molekylærbiologi. Den viktigste forskjellen mellom Sanger-sekvensering og Pyrosequencing er at Sanger-sekvensering bruker dideoksynukleotider for å avslutte syntesen av DNA for å lese nukleotidsekvensen mens pyrosekvensering oppdager pyrofosfatfrigjøringen ved å inkorporere nukleotidene og syntetisere den komplementære sekvensen for å lese den komplementære sekvensen.
Hva er Sanger Sequencing?
Sanger-sekvensering er en førstegenerasjons DNA-sekvenseringsmetode utviklet av Frederick Sanger og hans høyskoler i 1977. Den er også kjent som Chain Termination Sequencing eller Dideoxy-sekvensering siden den er basert på kjedeterminering av dideoxynucleotider (ddNTPs). Denne metoden ble mye brukt i mer enn 30 år inntil New Generation Sequencing (NGS) ble utviklet. Sanger-sekvenseringsteknikk muliggjorde oppdagelsen av riktig nukleotidrekkefølge eller festing av et bestemt DNA-fragment. Den er basert på selektiv inkorporering av ddNTP-er og terminering av DNA-syntese under in vitro DNA-replikasjonen. Fraværet av 3' OH-grupper for å fortsette fosfodiesterbindingsdannelse mellom tilstøtende nukleotider er et unikt trekk ved ddNTP-er. Derfor, når ddNTP er festet, opphører kjedeforlengelsen og avsluttes fra det punktet. Det er fire ddNTP-er – ddATP, ddCTP, ddGTP og ddTTP – som brukes i Sanger-sekvensering. Disse nukleotidene stopper DNA-replikasjonsprosessen når de inkorporeres i den voksende DNA-strengen og resulterer i varierende lengder av kort DNA. Kapillær gelelektroforese brukes til å organisere disse korte DNA-trådene etter størrelse på en gel som vist i figur 01.
Figur 1: Kapillær gelelektroforese av syntetisert kort DNA
For in vitro-replikasjon av DNA bør få krav stilles. De er DNA-polymeraseenzym, mal-DNA, oligonukleotidprimere og deoksynukleotider (dNTP). I Sanger-sekvensering utføres DNA-replikasjon i fire separate reagensrør sammen med fire typer ddNTP-er separat. Deoksynukleotider er ikke fullstendig erstattet av de respektive ddNTP-ene. En blanding av den spesielle dNTP (for eksempel; dATP + ddATP) er inkludert i røret og replikert. Fire separate rørprodukter kjøres på en gel i fire separate brønner. Ved å lese gelen kan sekvensen konstrueres som vist i figur 02.
Figur 02: Sanger-sekvensering
Sanger-sekvensering er en viktig teknikk som hjelper på mange områder innen molekylærbiologi. Humant genom-prosjekt ble vellykket gjennomført ved hjelp av Sanger-sekvenseringsbaserte metoder. Sanger-sekvensering er også nyttig i mål-DNA-sekvensering, kreft- og genetisk sykdomsforskning, genekspresjonsanalyse, menneskelig identifikasjon, patogendeteksjon, mikrobiell sekvensering osv.
Det er flere ulemper med Sanger-sekvensering:
- Lengden på DNA som sekvenseres kan ikke være lengre enn 1000 basepar
- Bare én streng kan sekvenseres om gangen.
- Prosessen er tidkrevende og dyr.
Derfor ble nye avanserte sekvenseringsteknikker utviklet med tiden for å overvinne disse problemene. Sanger-sekvensering er imidlertid fortsatt i bruk på grunn av sine svært nøyaktige resultater opp til omtrent 850 baseparlengdefragmenter.
Hva er pyrosequencing?
Pyrosequencing er en ny DNA-sekvenseringsteknikk basert på "sekvensering ved syntese". Denne teknikken er avhengig av påvisning av pyrofosfatfrigjøring ved nukleotidinkorporering. Prosessen brukes av fire forskjellige enzymer: DNA-polymerse, ATP-sulfurylase, luciferase og apyrase og to substrater adenosine 5' phosphosulfate (APS) og luciferin.
Prosessen starter med at primeren binder seg til den enkelttrådede DNA-malen og DNA-polymerase starter inkorporeringen av nukleotider som er komplementære til den. Når nukleotidene går sammen (nukleinsyrepolymerisering), frigjør det pyrofosfat (to fosfatgrupper bundet sammen) grupper og energi. Hver nukleotidtilsetning frigjør ekvimolar mengde pyrofosfat. Pyrofosfat konverteres til ATP av ATP-sulfurylase i nærvær av substrat APS. Den genererte ATP-en driver den luciferase-medierte konverteringen av luciferin til oksyluciferin, og produserer synlig lys i mengder som er proporsjonale med mengden ATP. Lys oppdages av en fotondeteksjonsenhet eller av fotomultiplikator og lager et pyrogram. Apyrase bryter ned ATP og ikke-inkorporerte dNTP-er i reaksjonsblandingen. dNTP-tilsetning gjøres én gang om gangen. Siden tilsetningen av nukleotid er kjent i henhold til inkorporering og påvisning av lys, kan sekvensen til malen bestemmes. Pyrogram brukes for å generere nukleotidsekvensen til prøve-DNA som vist i figur 03.
Pyrosequencing er svært viktig i enkeltnukleotidpolymorfismeanalyse og sekvensering av korte strekninger av DNA. Den høye nøyaktigheten, fleksibiliteten, den enkle automatiseringen og parallellbehandlingen er fordelene med pyrosekvensering fremfor Sanger-sekvenseringsteknikker.
Figur 03: Pyrosequencing
Hva er forskjellen mellom Sanger Sequencing og Pyrosequencing?
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
|
| Sanger-sekvensering er en DNA-sekvenseringsmetode basert på selektiv inkorporering av ddNTP-er ved DNA-polymerase og kjedeterminering. | Pyrosequencing er en DNA-sekvenseringsmetode basert på deteksjon av pyrofosfatfrigjøring ved inkorporering av nukleotid. |
| Bruk av ddNTP | |
| ddNTP-er brukes til å avslutte DNA-replikasjonen | ddNTP-er brukes ikke. |
| Enzymer involvert | |
| DNA-polymerase brukes. | Fire enzymer brukes: DNA-polymerase, ATP-sulfurylase, Luciferase og Apyrase. |
| Substrates Used | |
| APS og Luciferin brukes ikke. | Adenosine 5’ phosphosulfate (APS) og luciferin brukes. |
| Maksimal temperatur | |
| Dette er en langsom prosess. | Dette er en rask prosess. |
Summary – Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger-sekvensering og Pyrosequencing er to DNA-sekvenseringsmetoder som brukes i molekylærbiologi. Sanger-sekvensering konstruerer rekkefølgen av nukleotidene i sekvens ved å avslutte kjedeforlengelsen mens pyrosekvenseringen konstruerer den nøyaktige rekkefølgen av nukleotidene i sekvens ved å inkorporere nukleotider og påvise frigjøring av pyrofosfater. Derfor er hovedforskjellen mellom Sanger-sekvensering og Pyrosequencing at Sanger-sekvensering fungerer på sekvensering ved kjedeavslutning mens pyrosequencing fungerer på sekvensering ved syntese.
