Nøkkelforskjell – PCR-primere vs sekvenseringsprimere
Med den nylige utviklingen innen molekylærbiologi ble det utviklet forskjellige genetiske teknikker som gjorde undersøkelsesprosessene på forskjellige veier av emnet enkle og nøyaktige. PCR og andre sekvenseringsprosedyrer er to viktige slike teknikker. De bruker forskjellige underkomponenter. Primere betraktes som den viktigste underkomponenten som er felles for både PCR- og sekvenseringsteknikker. PCR-primere brukes for amplifisering av en bestemt DNA-sekvens, mens sekvenseringsprimere brukes i sammenheng med sekvensering av et DNA-fragment med den hensikt å avsløre dets spesifikke rekkefølge av nukleotidsekvensen. Dette er hovedforskjellen mellom PCR-primere og sekvenseringsprimere.
Hva er PCR-primere?
Polymerase Chain Reaction (PCR) er en genetisk teknikk som brukes innen molekylærbiologi for å forsterke en enkelt eller få kopier av et bestemt DNA-segment og for å oppnå mange millioner identiske kopier. I en PCR-reaksjon brukes forskjellige komponenter inkludert primere. Primere er korte DNA-tråder med en nukleotidlengde på 18-25, noe som gjør dem kompatible med start- og sluttregionen til DNA-fragmentene som skal amplifiseres. Primere kan være en forover-primer og en omvendt primer. Disse primerne binder seg til DNA-fragmentet på de spesifikke punktene der det får DNA-polymerase til å binde seg til den spesifikke primeren på stedet og initierer syntesen av den nye DNA-strengen.
Utvalget av primere er et viktig aspekt ved PCR-prosessen. Valget av lengden på primeren er viktig. Den ideelle lengden vil være 18-25 nukleotider. Hvis lengden er for kort eller for lang, vil ikke primerne binde seg til DNA-sekvensen som skal amplifiseres nøyaktig. Primere som er for korte i lengde fører til uspesifikk primer-annealing på forskjellige steder i DNA-sekvensen.
Figur 01: PCR-primere
Guanin- og Cytosin-innholdet (GC) i en god primer bør være i området 40-60. Primer-annealingstemperaturen og smeltetemperaturen er vitale faktorer under PCR. Smeltetemperaturen bør beregnes nøyaktig, og primerglødingstemperaturen bør være 5 0C lavere enn smeltetemperaturen. Smeltetemperaturen skal være 60 °C og 75 °C. For høye eller for lave temperaturer vil resultere i mindre aktiv DNA-polymeraseaktivitet.
Hva er sekvenseringsprimere?
Sekvenseringsprimere brukes i sammenheng med sekvensering av et DNA-fragment med den hensikt å avsløre dets spesifikke identitet. For å oppnå gode sekvenseringsresultater er primere og maler av høy kvalitet viktig. Derfor, når primere velges, bør de være unike for en bestemt region der vi ønsker å sekvensere. Det bør også være med en korrekt orientering der sekvensene vanligvis genereres fra 3' til 5' ender av primerne. Sekvensen skal mangle uønsket selvhybridisering som dannelse av hårnålsløkker. Den skal ikke inneholde påfølgende dannelse av guaninbaser.
Smeltetemperaturen (Tm) til primeren må være egnet for betingelsene for sekvenseringen. Derfor bør den ligge mellom 52oC og 74oC. Fremstilling av oligonukleotider som skal brukes som en primer bør renses for å oppnå ønsket full-lengde av sekvensen. Hvis oligonukleotidene inneholder urenheter, vil primersekvenssignaleringen overlegges fra forskjellige primingssteder, og det vil også redusere antall baseceller.
Figur 02: Sekvenseringsprimere
Primer-smeltetemperaturen (Tm) til et oligonukleotid bestemmer hvor sterke de komplementære DNA-trådene er hybridisert med hverandre. Tm kan betraktes som en termodynamisk beregning der den er avhengig av både DNA-sekvenser og flere forhold som s altkonsentrasjon. Tm er viktig under PCR der en variant k alt syklussekvensering brukes til å produsere en gruppe dideoksynukleotidterminerte fragmenter. Her vil primeren som sekvenseres initi alt bli annealet alternativt, deretter utvidet og til slutt denaturert for amplifikasjon. Derfor bør Tm-verdien ligge mellom 52oC og 74o C. Syntetiserte oligonukleotider kan fås fra DNA/RNA-synteselaboratorier iht. valg. Den lille synteseskalaen som brukes til DNA-sekvensering er vanligvis 50 nmol. Også viktigst av alt bør primerne som brukes til sekvensering renses for å være fri for urenheter som vil forhindre kvalitetsreduksjon.
Hva er likhetene mellom PCR-primere og sekvenseringsprimere?
- Både PCR-primere og sekvenseringsprimere er primere som brukes i amplifikasjonsprosessen av en målrettet DNA-sekvens.
- Både PCR-primere og sekvenseringsprimere er sammensatt av nukleotider.
- Både PCR-primere og sekvenseringsprimere er korte oligomerer.
Hva er forskjellen mellom PCR-primere og sekvenseringsprimere?
PCR-primere vs sekvenseringsprimere |
|
| PCR-primere er korte DNA-tråder med en nukleotidsekvenslengde på 18-25, noe som gjør dem kompatible med start- og sluttregionen til DNA-fragmentene som skal amplifiseres. | Sekvenseringsprimere er korte oligomerer som brukes i sammenheng med sekvensering av et DNA-fragment med den hensikt å avsløre dets spesifikke identitet. |
| Funksjon | |
| PCR-primere brukes for amplifikasjon av en bestemt DNA-sekvens. | Sekvenseringsprimere brukes i sammenheng med sekvensering av et DNA-fragment med den hensikt å avsløre dets spesifikke identitet. |
| Antall primere nødvendig | |
| To primere; en forover-primer og en revers-primer brukes som PCR-primer. | Trenger bare én primer som sekvenseringsprimer. |
Sammendrag – PCR-primere vs sekvenseringsprimere
Sekvenseringsprimere brukes i sammenheng med sekvensering av et DNA-fragment med den hensikt å avsløre dets spesifikke identitet. Én sekvenseringsprimer vil være nok til å kjøre prosessen. For å oppnå gode sekvenseringsresultater er primere og maler av høy kvalitet viktig. Derfor, når primere velges, bør de være unike for en bestemt region der vi ønsker å sekvensere. PCR-primere er korte DNA-tråder med en nukleotidlengde på 18-25 som er forenlig med start- og sluttområdet til DNA-fragmentene som skal amplifiseres. PCR-primere kan være en forover-primer og en revers-primer. Innholdet av guanin og cytosin (GC) i en god primer bør være i området 40-60. Primer-annealingstemperaturen og smeltetemperaturen er viktige aspekter under PCR. Dette er forskjellen mellom PCR-primere og sekvenseringsprimere.
