Nøkkelforskjell – SDS-side vs Western Blot
Western blotting er en teknikk som oppdager et spesifikt protein fra en proteinprøve. Denne teknikken utføres via flere nøkkeltrinn: gelelektroforese, blotting og hybridisering. Natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektroforese (SDS-side) er en slags gelelektroforeseteknikk som brukes til å skille proteiner i henhold til deres størrelser (molekylvekter). Western blot er et spesielt ark av en blotting-membran som brukes til å overføre det samme mønsteret av proteinene på SDS-siden. Den viktigste forskjellen mellom SDS Page og western blot er at SDS Page tillater separasjon av proteiner i en blanding mens western blot tillater deteksjon og kvantifisering av et spesifikt protein fra en blanding. Begge er nyttige i proteinanalysestudier.
Hva er SDS-side?
SDS Page er en gelelektroforeseteknikk som brukes for proteinseparasjon. Det er ofte brukt i biokjemi, genetikk, rettsmedisin og molekylærbiologi. Når proteinene er ekstrahert fra prøven, kjøres de på en gel som består av SDS og polyakrylamid. SDS er et anionisk vaskemiddel som brukes til å linearisere proteiner (denaturere proteiner) og for å gi en negativ ladning til lineariserte proteiner proporsjonal med deres molekylmasse. Polyakrylamid blir den faste støtten for gelen. Denaturerte proteiner som er negativt ladet migrerer mot den positive enden av apparatet gjennom gelen. I henhold til størrelsene på proteinene varierer migreringshastighetene mellom proteiner og separasjon skjer. Derfor er SDS-siden nyttig for separasjon av individuelle proteiner basert på deres størrelser.
Fremstillingen av polyakrylamidgelen for fraksjonering av proteiner er et avgjørende trinn i SDS-siden. Riktig konsentrasjon av polyakrylamid og typen tverrbindingsmiddel som brukes påvirker i stor grad de fysiske egenskapene til gelen, som gjør selve separasjonen av de forskjellige proteinene. Porestørrelsene til gelen bør administreres riktig for effektiv separasjon. SDS-side anses imidlertid som en høyoppløselig proteinseparasjonsteknikk.
SDS-sideteknikk har en stor begrensning i proteinanalyse. Siden SDS denaturerer proteiner før separasjon, tillater det ikke påvisning av enzymatisk aktivitet, proteinbindingsinteraksjoner, proteinkofaktorer osv.
Figur 01: SDS-side
Hva er Western Blot?
Western blotting-teknikk muliggjør deteksjon av et spesifikt protein fra en proteinblanding og måling av proteinets mengde og molekylvekt. Western blot er membranen som brukes under blotting-prosedyren for å få et speilbilde av proteinmønstrene i SDS-polyakrylamidgelen. Membranen som brukes til western blotting består for det meste av nitrocellulose eller polyvinylidendifluorid (PVDF). Membranen med det overførte proteinet kan brukes til å identifisere det ønskede proteinet. Det krever antistoff av høy kvalitet for påvisning av det ønskede proteinet ved hybridisering. Antistoffet binder seg til sitt spesifikke antigen og avslører tilstedeværelsen av det ønskede antigenet som er et protein.
Overføring av proteinene fra SDS-polyakrylamidgelen til westernblotten utføres ved elektroblotting. Det er en effektiv og rask metode som får proteinene til å elektroforese ut av gelen og gå over på nitrocellulosemembranen (western blot).
Figur 02: Western Blot
Hva er forskjellen mellom SDS-side og Western Blot?
SDS-side vs Western Blot |
|
| SDS-siden er en gelelektroforeseteknikk. | Western blot er en teknikk som utføres på en membran for å oppdage et spesifikt protein fra en blanding. |
| Bruk | |
| SDS-siden tillater separering av proteiner i henhold til deres størrelser. | Western blot tillater overføring av proteiner på SDS-sidegelen uten å endre mønsteret og tillater hybridisering med spesifikke antistoffer. |
| Ulemper | |
| Proteindenaturering, høye kostnader og tilstedeværelse av nevrotoksinkjemikalier er ulempene med denne teknikken. | Denne teknikken er tidkrevende og krever en god erfaren personlig og spesifikke kontrollerte forhold. |
Sammendrag – SDS-side vs Western Blot
SDS-side og western blot er to metoder involvert i proteinanalyse. SDS Page tillater enkel separering av proteiner på en gel i henhold til deres molekylvekt. Western blot bidrar til å bekrefte tilstedeværelsen og mengden av et spesifikt protein gjennom hybridisering med spesifikke antistoffer. Dette er forskjellen mellom SDS-side og western blot.
