Nøkkelforskjell – Northern vs Southern vs Western Blotting
Deteksjon av spesifikke sekvenser av DNA, RNA og proteiner er avgjørende for ulike typer studier innen molekylærbiologi. Gelelektroforese er en teknikk som skiller DNA, RNA og proteiner i henhold til deres størrelser. Fra gelprofilene påvises spesiell DNA-sekvens, RNA-sekvens eller protein ved hjelp av de spesielle teknikkene som kalles blotting og hybridisering med merkede prober. Det er tre forskjellige typer blottingmetoder, nemlig sørlig, nordlig og vestlig. Hovedforskjellen mellom nordlig sørlig og vestlig blotting ligger i typen molekyl den oppdager fra en prøve. Southern blotting er en metode som oppdager en spesifikk DNA-sekvens fra en DNA-prøve. Northern blotting er en teknikk som oppdager en spesifikk RNA-sekvens fra en RNA-prøve. Western blotting er en metode som oppdager et spesifikt protein fra en proteinprøve.
Hva er Southern Blotting?
Southern blotting-teknikk ble utviklet av E. M. Southern i 1975 for identifisering av en spesifikk DNA-sekvens fra en DNA-prøve. Dette er den første blotting-teknikken som ble introdusert i molekylærbiologi. Det muliggjorde påvisning av spesifikke gener fra DNA, spesifikke fragmenter fra DNA, etc. Det er flere trinn involvert i southern blotting-teknikk. De er som følger.
- DNA isoleres fra prøven og fordøyes med restriksjonsendonukleaser.
- Fordøyd prøve separeres med agarosegelelektroforese.
- DNA-fragmenter i gelen denatureres til enkelttråder ved bruk av en alkalisk løsning.
- Enkeltstrenget DNA overføres til en nitrocellulosefiltermembran ved kapillæroverføring.
- Overført DNA festes permanent på membranen.
- Fiksert DNA på membranen hybridiseres med merkede prober.
- Ubundet DNA vaskes av membranen ved vask.
- Røntgenfilm eksponeres for membranen og en autoradiograf utarbeides.
Southern blotting brukes for ulike aspekter av molekylærbiologi. Det er nyttig i RFLP-kartlegging, rettsmedisinske studier, DNA-metylering i genuttrykk, påvisning av muterte gener i genetiske lidelser, DNA-fingeravtrykk osv.
Figur 01: Southern Blotting Technique
Hva er Northern Blotting?
Northern blotting er en metode utviklet for å oppdage en spesifikk RNA-sekvens eller mRNA-sekvens fra en prøve for å studere genuttrykk. Denne teknikken ble utviklet av Alwine, Kemp og Stark i 1979. Den skiller seg fra de sørlige og vestlige blotting-teknikkene på grunn av flere trinn. Imidlertid utføres denne teknikken også via gelelektroforese, blotting og hybridisering med spesifikke merkede prober og deteksjon. Northern blotting-teknikk utføres som følger.
- RNA ekstraheres fra prøven og separeres ved gelelektroforese.
- RNA overføres fra gelen til en blotting-membran og fikseres.
- Membranen behandles med en merket probe fremstilt fra cDNA eller RNA (proben er komplementær til en spesifikk sekvens i prøven).
- Proben inkuberes med membranen for å binde seg med en spesifikk sekvens.
- Ubundne prober vaskes av.
- Hybridiserte fragmenter oppdages av en autoradiograf.
Northern blotting er et viktig verktøy i deteksjon og kvantifisering av hybridisert mRNA, studere RNA-nedbrytning, evaluering av RNA-halveringstid, påvisning av RNA-spleising, studere genuttrykk, etc.
Figur 02: Northern Blotting
Hva er Western Blotting?
Western blotting er en metode for å påvise et spesifikt protein fra en proteinblanding ved bruk av merket antistoff. Derfor er western blot også kjent som en immunoblot. Denne teknikken ble introdusert av Towbin et al i 1979, og den utføres nå rutinemessig i laboratoriene for proteinanalyse. Trinnene er som følger.
- Proteiner er ekstrahert fra prøven
- Proteiner separeres etter størrelse ved hjelp av polyakrylamidgelelektroforese
- Separerte molekyler overføres til en PVDF-membran eller nitrocellulosemembran ved elektroporering
- Membranen er blokkert for uspesifikk binding med antistoffene
- Overførte proteiner er bundet med primært antistoff (enzymmerkede antistoffer).
- Membranen vaskes for å fjerne ikke-spesifikt bundne primære antistoffer
- Bundne antistoffer påvises ved å tilsette et substrat og detektere det dannede fargede bunnfallet
Western blotting er nyttig ved påvisning av anti-HIV-antistoffer i en human serumprøve. Western blot kan også brukes som bekreftende test for hepatitt B-infeksjon og definitiv test for kugalskap.
Figur 03: Western Blotting
Hva er forskjellen mellom Northern Southern og Western Blotting?
Northern vs Southern vs Western Blotting |
|
| Type of Molecule Deected | |
| Northern Blotting | Northern blotting oppdager en spesifikk RNA-sekvens fra en RNA-prøve. |
| Southern Blotting | Southern blotting oppdager en spesifikk DNA-sekvens fra en DNA-prøve. |
| Western Blotting | Western blotting oppdager et spesifikt protein fra en proteinprøve. |
| Type of Gel | |
| Northern Blotting | Denne bruker agarose/formaldehydgel. |
| Southern Blotting | Dette bruker en Agarose-gel. |
| Western Blotting | Dette bruker polyakrylamidgel. |
| Blottetmetode | |
| Northern Blotting | Dette er en kapillæroverføring. |
| Southern Blotting | Dette er en kapillæroverføring. |
| Western Blotting | Dette er en elektrisk overføring. |
| prober brukt | |
| Northern Blotting | cDNA- eller RNA-prober merket radioaktivt eller ikke-radioaktivt. |
| Southern Blotting | DNA-prober er merket radioaktivt eller ikke-radioaktivt. |
| Western Blotting | Primære antistoffer brukes som prober. |
| Deteksjonssystem | |
| Northern Blotting | Dette gjøres ved hjelp av en autoradiograf, eller deteksjon av lys eller fargeendring. |
| Southern Blotting | Dette gjøres ved hjelp av en autoradiograf, deteksjon av lys eller fargeendring. |
| Western Blotting | Dette gjøres ved å oppdage lys eller fargeendring. |
Sammendrag – Northern vs Southern vs Western Blotting
Blotting er en spesiell teknikk utviklet for identifikasjon av spesifikt DNA, RNA eller protein fra prøvene. Det er tre separate blotting-prosedyrer, nemlig nordlig, sørlig og vestlig, for å oppdage en bestemt type molekyl. Northern blotting-teknikk er designet for å oppdage en spesifikk RNA-sekvens fra en blanding av RNA. Southern blotting-teknikk muliggjør deteksjon av en spesifikk DNA-sekvens fra en DNA-prøve, og western blotting-teknikk er utviklet for å identifisere et spesifikt protein fra en proteinblanding.
