Nøkkelforskjell – kloning vs subkloning
Kloning og subkloning er molekylærbiologiske prosedyrer som skaper genetisk identiske celler eller organismer som bærer DNAet eller genet som er av interesse. Kloning er en teknikk som involverer innsetting av det interesserte genet eller DNA i en vektor, replikering av det i en vertsbakterie og produksjon av celler eller organismer som er eksakte kopier av den genetiske sammensetningen. Subkloning er en teknikk som involverer innsetting av genet av interesse, som allerede er satt inn i en vektor, i en sekundær vektor, replikering av det i en vertsbakterie og produksjon av genetisk identiske kopier av celler eller organismer. Nøkkelforskjellen mellom kloning og subkloning er at ved kloning fortsetter genet av interesse, når det er ligeret inn i en vektor, kloningsprosessen mens det allerede klonede genet av interesse blir separert fra modervektoren og satt inn igjen i subkloningen. en mottakervektor og fortsett prosessen.
Hva er kloning?
Kloning er prosedyren som produserer genetisk identiske organismer eller celler. I naturen skjer kloning ved hjelp av aseksuell reproduksjon. Når det ikke er noen genetisk rekombinasjon eller endring, mottar datterceller samme genetiske sammensetning av forelderen. Prokaryote og eukaryote organismer lager kloner ved binær fisjon, spirende, mitose osv. I molekylærbiologi er kloning av gener eller spesifikke fragmenter av DNA en populær metode for å studere strukturen og funksjonen til den aktuelle DNA-delen.
Hovedmålet med molekylær kloning er å lage millioner av kopier av genetisk identiske celler eller organismer som bærer DNA-fragmentet av interesse (hovedsakelig gener). Den skaper organismer med eksakte genetiske kopier av en annen. Primært blir spesifikke gener klonet i molekylære studier for å oppnå strukturell og funksjonell informasjon og for DNA-sekvensering. Også for produksjon av spesifikke proteiner eller produkter i stor skala, er kloning mye brukt.
kloningsprosedyre
De grunnleggende trinnene i kloningsprosedyren er som følger.
- Identifisering og isolering av genet av interesse. (Amplifikasjon av genet av interesse ved PCR).
- Restriksjonsfordøyelse av genet av interesse (restriksjonsendonuklease kuttet genet).
- Restriksjonsfordøyelse av vektor-DNA. (Vektor-DNA kuttes også ved bruk av den samme restriksjonsendonukleasen).
- Innsetting av genet i vektoren og dannelse av det rekombinante molekylet.
- Transformasjon av den rekombinante vektoren til en vertsbakterie.
- Isolering og identifikasjon av de transformerte bakteriene (plasmidvektor bør inneholde et selekterbart gen, oftest et antibiotikaresistensgen for å screene transformerte bakterier).
- Rekombinant genuttrykk i verten.
Figure_01: Kloningsprosedyre
Hva er subkloning?
Subkloning er en prosedyre for å flytte et gen av interesse fra en vektor til en annen vektor for å se ekspresjonen av genet for å få den ønskede funksjonaliteten til genet. I denne metoden er to vektorer involvert; nemlig overordnet vektor og destinasjonsvektor. Klonede inserts flyttes igjen inn i en andre vektor i subkloning. Målet med å overføre genet fra den første vektoren til den andre vektoren er å oppnå noe som ikke kunne gjøres av den første vektoren eller å skille et gen igjen i det allerede klonede fragmentet av DNA og uttrykke det alene. Restriksjonsenzymer brukes i denne prosedyren i begynnelsen.
subkloningsprosedyre
De grunnleggende trinnene for subkloning er som følger.
- Ved hjelp av restriksjonsendonukleaser, separasjon av DNA av interesse i donorplasmidet (overordnet vektor).
- Amplifikasjon av DNA av interesse ved bruk av PCR.
- Rensing av PCR-produktet (DNA av interesse) ved gelelektroforese.
- Åpning av mottakerplasmidet med samme restriksjonsendonukleaser som brukes til å skille DNA av interesse i moderplasmidet.
- Ligering av DNA av interesse (gen) inn i mottakerplasmidet for å lage det subklonede plasmidet.
- Transformasjon av den subklonede vektoren til en kompetent vertsbakterie.
- Sjemning av transformerte celler.
- Rensing av plasmid-DNA og bruk for DNA-sekvensering eller ekspresjon av genene for å oppnå de ønskede produktene.
Subkloning utføres ved anledninger av isolering av ett gen fra den klonede gruppen av gener eller når genet av interesse må overføres til et nyttig plasmid for å se den nøyaktige funksjonen til genet av interesse.
Figure_02: Subkloningsprosedyre
Hva er forskjellen mellom kloning og subkloning?
Kloning vs Subcloning |
|
| Kloning er prosedyren som produserer genetisk identiske organismer eller celler. | Subkloning er en prosedyre for å flytte et gen av interesse fra en vektor til en annen vektor for å se ekspresjonen av genet for å oppnå ønsket funksjonalitet til genet. |
| Prosess | |
| Skill DNA-et av interesse fra organismen og settes inn i en vektor én gang og klones | Allerede klonet DNA separeres fra den første vektoren og settes inn i en andre vektor og klones. |
| Sett inn bevegelse via vektorer | |
| Flytter ikke innlegg (DNA av interesse) fra en vektor til en annen vektor. | Flytt innlegg fra overordnet vektor til destinasjonsvektor. |
Sammendrag – Kloning vs Subkloning
Kloning skaper genetisk identiske celler eller organismer med det innsatte genet eller DNA av interesse. Det fortsetter gjennom separasjon og innsetting av DNA av interesse i en vektor og ekspresjon i en vertsbakterie. Subkloning deler lignende trinn med kloning. Ved subkloning blir imidlertid allerede klonet DNA-fragment (gen av interesse) satt inn i en vektor og transformert til en vertsbakterie. Det er hovedforskjellen mellom kloning og subkloning.
