Nøkkelforskjell – RT PCR vs QPCR
Polymerase Chain Reaction er en teknikk som brukes til å forsterke en bestemt region av DNA in vitro. På grunn av oppfinnelsen av denne teknikken av Kary Mullis i 1983, er forskere i stand til å lage tusen til millioner av kopier av spesifikke DNA-fragmenter for forskningsformål. For tiden har det blitt en vanlig og rutinemessig utført teknikk i kliniske og forskningslaboratorier for et bredt spekter av bruksområder. Det finnes variasjoner av tradisjonell PCR-teknikk som RT PCR, nestet PCR, multipleks PCR, Q PCR, RT – QPCR osv. RT PCR og Q PCR er to viktige variasjoner av PCR. Den viktigste forskjellen mellom RT PCR og Q PCR er at RT PCR brukes til å oppdage genuttrykk gjennom opprettelse av komplementære DNA (cDNA) transkripsjoner fra RNA mens Q PCR brukes til å kvantitativt måle PCR-produktene sanntid ved bruk av fluorescerende fargestoffer.
Hva er RT PCR?
Revers transkripsjonspolymerasekjedereaksjon (RT PCR) er en variant av PCR som brukes til å påvise RNA-ekspresjon. Det er en svært viktig metode for å oppdage mRNA-ekspresjon i vev. RT PCR brukes når utgangsmaterialet til prøven er RNA. I RT PCR blir malen mRNA først omdannet til komplementært DNA. Dette trinnet katalyseres av enzymet revers transkriptase og prosessen er kjent som revers transkripsjon. For det andre brukes tradisjonell PCR for det nylig syntetiserte cDNA for amplifikasjonen.
RT PCR er en svært sensitiv teknikk som krever en relativt liten mengde RNA-prøve. RT PCR er ofte brukt i diagnostisering og kvantifisering av RNA-arter, spesielt RNA-virus som humant immunsviktvirus og hepatitt C-virus.
Figur 01: RT PCR-teknikk
Hva er QPCR?
Quantitative PCR (QPCR) er en variant av PCR som brukes til å kvantitativt måle PCR-produktene. Det blir også referert til som sanntids polymerasekjedereaksjon siden den måler forsterkningen av sanntid ved bruk av sanntids PCR-maskin. Det er en egnet metode for å bestemme mengden av en målsekvens eller gen som er tilstede i en prøve. Det interessante med QPCR er at det kombinerer både amplifikasjon og sann kvantifisering i ett enkelt trinn. Derfor kan behovet for gelelektroforese ved deteksjon elimineres ved QPCR-teknikk. QPCR bruker fluorescerende fargestoffer for å merke PCR-produkter under PCR-reaksjonene som til slutt fører til direkte kvantifisering. Når PCR-produktene akkumuleres, akkumuleres også de fluorescerende signalene, og det vil bli målt av sanntidsmaskinen. QPCR kan kombineres med RT PCR. Det er kjent som RT – QPCR eller QRT – PCR og regnes som en kraftigst, sensitiv og kvantitativ metode for påvisning av RNA-nivåer i cellene eller vevet.
SYBR Green og Taqman er to metoder som brukes for å oppdage eller se forsterkningsprosessen av sanntids-PCR. SYBR Green-metoden utføres ved å bruke et fluorescerende fargestoff k alt SYBR green og oppdager amplifikasjonen ved å binde fargestoffet for å produsere dobbelttrådet DNA. Taqman utføres ved bruk av dobbeltmerkede prober og detekterer amplifikasjonen ved degradering av proben med Taq-polymerase og frigjøring av fluoroforen som vist i figur 02. Begge metodene overvåker fremdriften av amplifikasjonsprosessen og rapporterer mengden av produktet i sanntid..
Sanntids-PCR har en lang rekke bruksområder som kvantifisering av genuttrykk, mikroRNA og ikke-kodende RNA-analyse, SNP-genotyping, påvisning av kopinummervarianter, påvisning av sjeldne mutasjoner, påvisning av genmodifiserte organismer, påvisning av smittestoffer osv.
Figur 02: Kvantitativ PCR-teknikk
Hva er forskjellen mellom RT PCR og QPCR?
RT PCR vs QPCR |
|
| RT PCR er en teknikk som brukes til å oppdage genuttrykk ved amplifikasjon. | QPCR er en teknikk som forsterker DNA og kvantifiserer PCR-produktene i sanntid. |
| Involvering av omvendt transkriptase-enzym | |
| Enzym revers transkriptase brukes for RT PCR. | Enzym revers transkriptase brukes ikke for QPCR. |
| Bruk av fluorescensmerkede molekyler | |
| Fluorescerende merket fargestoffer eller prober brukes ikke for RT PCR. | Fluorescensmerkede fargestoffer eller prober brukes for QPCR. |
| Kvantifisering av PCR-produkt | |
| Med mindre den er koblet til QPCR, kvantifiserer ikke RT PCR PCR-produktet. | QPCR måler PCR-produktet kvantitativt. |
| Startmateriale | |
| Utgangsmaterialet er mRNA. | Utgangsmaterialet er DNA. |
| Syntese av cDNA | |
| Komplementært DNA produseres under RT PCR. | Komplementært DNA produseres ikke under QPCR. |
Sammendrag – RT PCR vs QPCR
RT PCR og QPCR er to versjoner av tradisjonell PCR. RT PCR-teknikk utføres for mRNA-prøver og den drives av revers transkripsjon og produksjon av cDNA. QPCR brukes til å kvantifisere PCR-produkter under sanntids PCR-termiske sykluser ved bruk av fluorescerende fargestoffer eller merkede prober. I QPCR er mengden av PCR-produkt representert av de utsendte fluorescerende signalene fra prøven. RT PCR er populært brukt som en amplifikasjonsprosess mens QPCR ofte brukes som en kvantifiseringsprosess. Dette er forskjellen mellom RT PCR og QPCR.
