Key Difference – Blunt vs Sticky End Ligation
Restriksjonsendonukleaser er spesifikke enzymer som kutter dobbelttrådet DNA (dsDNA). De er også kjent som molekylær saks i molekylærbiologi. Restriksjonsenzymer er i stand til å gjenkjenne spesifikke korte sekvenser av dsDNA kjent som gjenkjennelsessteder og sp alte fosfodiester- og hydrogenbindinger for å åpne dobbelttråder. Som et resultat av sp altning av disse enzymene produseres DNA-fragmenter med forskjellige typer ender som klebrige ender og butte ender. DNA-ligase er et enzym som brukes i molekylærbiologi for å forbinde to tilstøtende DNA-tråder ved å danne nye bindinger. Trinnet er kjent som ligering, og i henhold til typen DNA-ende som er ligert, kan de refereres til som butt end-ligation og sticky end-ligation. Nøkkelforskjellen mellom stump og klebrig endeligering er at stump endeligering skjer mellom DNA-fragmenter som inneholder to stumpe ender, mens klebrig endeligering skjer mellom 5' og 3' overheng. Sammenlignet med stumpe endeligering er klebrig endeligering mer effektiv og stabil.
Hva er en Blunt End Ligation?
Noen restriksjonsendonukleaser kan kutte DNA ved de motsatte basene og produsere stumpe DNA-fragmenter. Disse enzymene er kjent som blunt end cutters; de klyver rett ned til midten av restriksjonsstedet uten å etterlate enkelttrådet overhengende baser. Stumpe ender er også kjent som ikke-overhengende ender siden de ikke har 3' og 5' overhengende baser i endene. Begge trådene avsluttes fra baseparene i butte ender. Vanlige butt end cutting enzymer er EcoRV HaeIII, AluI og SmaI.
Blunt end ligering er involvert mellom to butte ender. Det er ikke en ligering av utstående baser. Denne ligeringen er mindre effektiv enn klebrig endeligering. I noen tilfeller blir imidlertid ligering med stump ende mer fordelaktig enn ligering av klebrig ende, spesielt ved ligering av PCR-produkter. PCR-produkter produseres alltid med stumpe ender. Blunt-endeligering krever ikke komplementære ender i DNA for ligeringen.
Figur 01: Produksjon av stump slutt med Eco RV-enzym
Hva er en Sticky End Ligation?
Noen restriksjonsendonukleaser er i stand til å kutte dsDNA, og etterlater et overhengende stykke enkelttrådet DNA på slutten. Disse endene er kjent som klebrige eller overhengende ender. Klebrig endeligering skjer mellom to DNA-fragmenter som inneholder matchende overheng fordi klebrige ender har uparrede baser og krever komplementære baser for å danne bindinger. Derfor er det nødvendig å bruke det samme restriksjonsenzymet for begge DNA-kildene for å produsere de matchende ligeringsfragmentene.
Ligering av klebrig ende er mer effektiv og er ofte svært ønskelig i kloningsprosesser. Det er flere restriksjonsenzymer som produserer klebrige ender. De er EcoRI, BamHI, HindIII osv.
Figur 02: Sticky end-produksjon av Eco RI-enzym
Hva er forskjellen mellom Blunt og Sticky End Ligation?
Blunt vs Sticky End Ligation |
|
| Brunt end ligering skjer mellom to butt end DNA-fragmenter. | Ligering med klebrig ende skjer mellom to matchende DNA-fragmenter med klebrige ender. |
| Enzymes | |
| Kuttere med stumpe ender produserer butte ender. | Klister med klebrige ende gir klissete eller sammenhengende ender. |
| Krav for samsvarende slutter | |
| Det krever ikke matchende fragmenter eller komplementære baser. | Det krever komplementære baser i endene for å danne basepar. |
| Effektivitet | |
| Det er mindre effektivt enn klebrig endeligering | Det er mer effektivt enn ligering med stump ende. |
Sammendrag – Blunt vs Sticky End Ligation
Restriksjonsendonukleaser er i stand til å sp alte dsDNA og produsere DNA-fragmenter med forskjellige ender. De gjenkjenner spesifikke sekvenser og begrenser DNA som skaper klissete og butte ender. Klistrete ender har uparrede baser på slutten av fragmentene. Stumpe ender skapes på grunn av en rett sp alting og de har basepar i endene. Ligering av klebrig ende krever to komplementære enkelttrådede DNA-stykker. Blunt-endeligering forekommer mellom hvilke som helst to butt-endefragmenter. Dette er forskjellen mellom stump og klebrig ligering.
