Nøkkelforskjell – papir vs tynt lag vs kolonnekromatografi
Papirkromatografi, tynnsjiktskromatografi og kolonnekromatografi er tre typer kromatografiske teknikker. Nøkkelforskjellen mellom papirkromatografi, tynnsjiktskromatografi og kolonnekromatografi er basert på typen stasjonær fase som brukes i kromatografiteknikken. Papirkromatografi bruker et cellulosepapir som sin stasjonære fase, tynnlagskromatografi bruker alumina eller silikagel som sin stasjonære fase, mens kolonnekromatografi bruker en kolonne pakket med et passende matrisemateriale som sin stasjonære fase.
I prosessen med separasjon og identifikasjon av biomolekyler som proteiner og karbohydrater, er kromatografi en viktig biofysisk teknikk som brukes. Kromatografi skiller forbindelser basert på deres løselighet, størrelse og ladning. Basert på separasjonsmekanismen bruker kromatografi mekanismer som ionebytte, absorpsjon, partisjon og størrelsesekskludering og det er tre kromatografiske teknikker; nemlig papir-, tynnsjikts- og kolonnekromatografi. Papirkromatografi er basert på faststoff-væske-adsorpsjonen og løseligheten til forbindelsen, og den bruker et cellulosepapir som stasjonær fase. Tynnsjiktskromatografi er basert på fast-væske-adsorpsjon av molekyler. Den har en stasjonær fase som vanligvis er laget av alumina eller silikagel og den mobile fasen som er løsningsmidlet. Kolonnekromatografi bruker en kolonne pakket med en matrise som brukes til å skille molekyler hovedsakelig basert på deres størrelse, affinitet eller ladning.
Hva er papirkromatografi?
Papirkromatografi er den enkleste typen kromatografi som brukes, og den brukes ikke til omfattende forskning. Det brukes hovedsakelig i studentlaboratorier for å identifisere biomolekyler som aminosyrer og karbohydrater som finnes i blandinger. Papirkromatografi bruker en stasjonær fase som er laget ved hjelp av cellulosepapir eller Whatman-filterpapir og en mobil fase som vanligvis fremstilles ved bruk av organiske løsemidler som n-butanol osv. Den stasjonære fasen er mettet med vann, noe som gjør den stasjonære fasen flytende. Således, når forbindelsene er flekkete og får løpe i nærvær av den mobile fasen, avhengig av løseligheten til forbindelsene, separeres de. Således, etter utviklingen av kromatogrammet, kan farging gjøres for å bestemme løpslengden til hver forbindelse. Retensjonsfaktoren kan dermed beregnes.
Figur 01: Papirkromatografi
Papirkromatografi kan videre klassifiseres som stigende papirkromatografi og synkende papirkromatografi avhengig av retningen til det løpende løsemidlet.
Hva er tynnlagskromatografi?
Tynnlagskromatografi eller TLC er en vanlig teknikk for å identifisere forskjellige aminosyrer som er tilstede i en blanding eller for identifikasjon av proteiner. Teknikken for separasjon er basert på fast-væske-adsorpsjon. Under tynnsjiktskromatografi brukes en plate laget av alumina eller silikagel som stasjonær fase. Løsningsmiddelblandingen varierer etter behov og kan bruke forskjellige kombinasjoner av organiske forbindelser som n-butanol, eddiksyre og vann for å fremstille løsningsmidlet. Forbindelsene som skal separeres flekkes på platen og dyppes ned i løsningsmiddelblandingen. Når løsningsmidlet beveger seg opp basert på kapillærvirkningen gitt av platen, beveger forbindelsene på platen seg også avhengig av deres løselighet i løsningsmidlet.
Figur 02: Tynnlagskromatografi
Deteksjonen av flekkene etter kromatogrammet kjøres med forskjellige fargingsprosedyrer. Noen bruker ninhydrinfarging som er en ganske giftig metode for farging. Moderne tynnsjiktskromatogrammer bruker fluorescensteknikker for å se kromatogrammet etter kjøringen. Avhengig av avstandene den har tilbakelagt, kan retensjonstiden for hver forbindelse beregnes. Dette kan brukes til å identifisere typen forbindelse som er separert basert på blandingen som brukes. TLC brukes hovedsakelig til å identifisere aminosyrer i en proteinblanding og også for å skille forskjellige typer monosakkarider som finnes i en blanding.
Hva er kolonnekromatografi?
Søylekromatografi er et bredt begrep som brukes for å beskrive mange typer kromatografiteknikker som bruker den kolonnebaserte separasjonsmetoden. Ved kolonnekromatografi brukes en fysisk kolonne med et pakkemateriale for å separere forbindelsene. Separasjonen kan være basert på forskjellige fysiske egenskaper som utvises av forbindelsene. Disse egenskapene kan være ladningen, størrelsen, 3D-konformasjonen og bindingskapasiteten osv. Dermed fungerer kolonnen pakket med matrisematerialet som den stasjonære fasen og vaskebufferen påført kolonnen fungerer som den mobile fasen.
Hvis molekylene er separert basert på størrelsen, pakkes pakkematerialet på en måte som etterlater porer som forbindelsene kan reise gjennom. Dermed blir de større molekylene som ikke kan strømme gjennom porene eluert først, mens de mindre molekylene bruker mye lengre tid på å eluere.
Figur 03: Kolonnekromatografi
Hvis molekylene separeres basert på ladningen, vil den stasjonære fasen inneholde enten en anion- eller kationbytter som forbindelsene vil bli tiltrukket til basert på ladningen. Under vasketrinnet vil således de ikke-bundne forbindelsene bli eluert. Ved tilsetning av elueringsbufferen vil de bundne ladede forbindelsene bli eluert. Påvisningen av disse elueringsmidlene er hovedsakelig basert på spektrofotometriske teknikker.
Hva er likhetene mellom tynt papir- og kolonnekromatografi?
- All Paper Thin Layer and Column Chromatography tre teknikker brukes for separering av biomolekyler som aminosyrer, proteiner og karbohydrater.
- Tynne papir- og kolonnekromatografiteknikker har en mobil fase og en stasjonær fase.
- Tynne papir- og kolonnekromatografiteknikker bruker biofysiske mekanismer for separasjon.
Hva er forskjellen mellom tynt papir- og kolonnekromatografi?
Papir vs Thin Layer vs Column Chromatography |
|
| Papirkromatografi | Papirkromatografi er en kromatografisk teknikk som brukes til å separere forbindelser basert på væske-væske-adsorpsjonen og løseligheten til forbindelsen. Den bruker cellulosepapir som sin stasjonære fase. |
| tynnlagskromatografi | Tynnlagskromatografi er en annen kromatografisk teknikk basert på fast-væske-adsorpsjon av molekyler. Den har en stasjonær fase laget av alumina eller silikagel og et løsemiddel som den mobile fasen, som er løsningsmidlet. |
| kolonnekromatografi | Søylekromatografi bruker en kolonne pakket med en matrise som brukes til å skille molekyler hovedsakelig basert på deres størrelse, affinitet eller ladning. |
| Stasjonær fase | |
| Papirkromatografi | Papir laget av nitrocellulose fra Whatman brukes som stasjonær fase i papirkromatografi. |
| tynnlagskromatografi | Alumina eller silikagel brukes som den stasjonære fasen av tynnsjiktskromatografien. |
| kolonnekromatografi | En kolonne pakket med egnet pakkemateriale brukes som stasjonær fase i kolonnekromatografien. |
| Mobilfase | |
| Papirkromatografi | Løsemiddel som løper er den mobile fasen av papirkromatografien. |
| tynnlagskromatografi | Løsningsmiddel som løper er den mobile fasen av tynnsjiktskromatografien. |
| kolonnekromatografi | Vaskebuffer er den mobile fasen av kolonnekromatografien. |
| Mekanismer som brukes for separering | |
| Papirkromatografi | Papirkromatografi er basert på fast-væske-absorpsjon. |
| tynnlagskromatografi | Tynnlagskromatografi er basert på fast-væske-absorpsjon. |
| kolonnekromatografi | Søylekromatografi er basert på størrelsesekskludering, ladning og form. |
| Elusjonsbuffer | |
| Papirkromatografi | Ikke nødvendig ved papirkromatografi. |
| tynnlagskromatografi | Ikke nødvendig for tynnsjiktskromatografi. |
| kolonnekromatografi | Nødvendig i kolonnekromatografi. |
| Detection | |
| Papirkromatografi | Fekking og ved å bestemme retensjonsfaktoren. |
| tynnlagskromatografi | Fekking og ved å bestemme retensjonsfaktoren. |
| kolonnekromatografi | Spektrofotometrisk bestemmelse. |
Sammendrag – Papir Thin Layer vs Column Chromatography
Papirkromatografi, TLC og kolonnekromatografi er separasjonsteknikker som brukes til å skille biomolekyler som proteiner, aminosyrer og karbohydrater (hovedsakelig monosakkarider). Papirkromatografi bruker et cellulosepapir som stasjonær fase, og separasjonsmekanismen er basert på fast-væske-adsorpsjon. TLC bruker også fast-væske-adsorpsjonsmekanismer. Molekylene separeres på den stasjonære fasen, avhengig av deres løselighet i den mobile fasen. Kolonnekromatografi bruker fysiske egenskaper som størrelse, form, ladning og molekylvekten til forbindelsen for å skille. Kolonnen pakket med matrisematerialet fungerer som den stasjonære fasen, mens vaskebufferen fungerer som løsningsmiddelfasen. Dette er forskjellen mellom et papirtynt lag og kolonnekromatografi.
