Nøkkelforskjell – SDS-side kontra opprinnelig side
SDS og native page er to typer polyakrylamidgelelektroforeseteknikker som brukes i molekylærbiologi. Den viktigste forskjellen mellom SDS Page og Native Page er typen polyakrylamidgel som brukes. I SDS-siden brukes en denaturerende gel, derfor separeres molekyler basert på molekylvekten deres. I kontrast, i Native Page, brukes ikke-denaturerende geler. Derfor separeres molekyler basert på størrelse, ladning og form.
Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Page) bruker en gel laget ved å polymerisere akrylamidmonomerer med metylenbisakrylamid. Polyakrylamidet er tøffere og mer varmestabilt enn agarose. Polyakrylamidgelene har en mindre porestørrelse som muliggjør effektiv separering av proteiner. Det er to hovedtyper av sideoppsett, nemlig SDS-side og Native Page. SDS Page eller Sodium-Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gelelektroforese separerer proteiner basert på deres molekylvekter. Denaturerende geler brukes i SDS-siden. Native Page bruker ikke-denaturerende geler og skiller proteiner basert på størrelse, ladning og form (3D-konformasjon).
Hva er SDS-side?
SDS-siden er den vanligste elektroforetiske teknikken som brukes til å separere proteiner basert på deres molekylvekt. Gelen lages ved å tilsette SDS (Sodium dodecyl sulfate), som er et vaskemiddel. SDS proteser proteiner til monomerer. SDS er et anionisk vaskemiddel. Derfor tilfører det en netto negativ ladning til proteinene innenfor et bredt pH-område. Når den netto negative ladningen påføres proteinmolekylene, på grunn av ladningsvariasjonen, brytes de komplekse strukturene ned. På grunn av den negative ladningen tiltrekker proteiner seg mot den positive enden. Molekyler med lavere molekylvekt beveger seg derfor raskere på gelmatrisen og kan observeres nær anoden, mens proteiner med høyere molekylvekt observeres nærmere brønnene.
Figur 01: SDS-side
SDS-bindingen til polypeptidkjeden er proporsjonal med dens relative molekylmasse. Derfor kan molekylmassen også bestemmes via SDS-side. Fargingen av SDS Page-gelene gjøres ved farging av bromfenolblått. Anvendelser av SDS-side varierer i større grad der det kan brukes til å estimere den relative molekylmassen og for å bestemme den relative mengden av proteiner i en proteinblanding. SDS-siden kan også brukes til å bestemme proteinfordelingen i en blanding av proteiner. SDS Page brukes også for å rense og vurdere proteiner. Den brukes som en foreløpig prosedyre for western blotting og hybridisering, som igjen brukes til proteinkartlegging og identifikasjon.
Hva er opprinnelig side?
Native polyakrylamidgelelektroforese (Native Page) bruker en ikke-denaturerende gel. Derfor tilsettes ikke SDS eller noe annet denatureringsmiddel til gelmatrisen. I Native Page er separasjonen av proteiner basert på ladningen og størrelsen på proteinet. Derfor avhenger mobiliteten til proteinet av ladningen og størrelsen på proteinet.
Ladingen til proteinet avhenger av sidekjedene til aminosyrene. Hvis sidekjedene er negativt ladet, vil proteinet få en samlet negativ ladning og omvendt. Proteiner beholder en 3D-konformasjon på grunn av foldingen som finner sted. Folding er resultatet av flere bindingstyper i proteiner som disulfidbindinger, hydrofobe interaksjoner og hydrogenbindinger. Derfor, hvis den opprinnelige siden bæres ved en nøytral pH, vil proteinene bli separert i henhold til proteinets molekylære form. Derfor kan Native Page brukes som en sensitiv teknikk for å oppdage endringen i ladning eller konformasjon av proteinet.
Den største fordelen med native Page er at proteinet som brukes til Page-analysen kan gjenvinnes i sin opprinnelige tilstand etter Page-analysen, siden proteinet ikke blir forstyrret under prosessen. Native Page er en relativt høy gjennomstrømningsteknikk, og stabiliteten til proteinet økes.
Figur 02: Innfødt side
Etter at gelkjøringen er fullført, kan Native Page-gelen ses ved å farge med bromfenolblått eller en annen egnet fargereagens. Anvendelsene til Native Page inkluderer separasjon av sure proteiner inkludert glykoproteiner som humant rekombinant erytropoietin eller identifisering av proteiner som finnes i bovint serumalbumin (BSA).
Hva er likhetene mellom SDS-side og opprinnelig side?
- Både SDS Page- og Native Page-systemer bruker polyakrylamidgel som matrise for gelen.
- Begge brukes til separasjon og identifikasjon av proteiner.
- Begge bruker elektroforetisk mobilitet for å separere forbindelsene.
- Begge kan gjøres på en vertikal måte eller horisontal måte (for det meste gjort som vertikale sideoppsett fordi kjørelengden er lengre).
- Elektroforeseapparatet inkludert geltanken, kammer, strømforsyningen er nødvendig for driften av begge teknikkene.
- Visualiseringen av gelen kan gjøres ved hjelp av fargemetoder i begge teknikkene.
Hva er forskjellen mellom SDS-side og opprinnelig side?
SDS-side kontra opprinnelig side |
|
| SDS Page eller Sodium-dodecyl sulfate Page skiller proteiner basert på deres molekylvekt, og den bruker en denaturerende gel. | Native Page bruker ikke-denaturerende geler og skiller proteiner basert på størrelse, ladning og form (3D-konformasjon). |
| Type gel | |
| En denaturerende gel er brukt i SDS-siden. | En ikke-denaturerende gel brukes på den opprinnelige siden. |
| Tilstedeværelse av SDS | |
| SDS er til stede som et vaskemiddel for å gi en negativ ladning på prøven på SDS-siden. | SDS finnes ikke på den opprinnelige siden. |
| Separasjonsgrunnlag | |
| Separasjon av proteiner avhenger av molekylvekten til proteinet på SDS-siden. | Separasjon avhenger av størrelsen og formen til proteinmolekylet på den opprinnelige siden. |
| Stability of the Protein | |
| Stabiliteten til proteinet er lav i SDS-siden. | Proteinets stabilitet er høy på den opprinnelige siden. |
| Recovery of the Original Protein | |
| Ikke mulig da det er denaturert på SDS-siden. | Mulig på den opprinnelige siden. |
Sammendrag – SDS-side kontra opprinnelig side
SDS Page og Native Page er to typer polyakrylamidgelelektroforeseteknikker som brukes til å skille proteiner. SDS Page er behandlet med et vaskemiddel k alt SDS. SDS gir en generell negativ ladning til proteinet, som deretter resulterer i denaturering av proteinet. Derfor separeres proteinene basert på deres molekylvekt. I motsetning til dette bruker Native Page-teknikken ikke noe denatureringsmiddel. Dermed blir proteinene enten separert basert på størrelse eller form. Dette er forskjellen mellom SDS-siden og den opprinnelige siden.
