Nøkkelforskjellen mellom nick-oversettelse og endefylling er at nick-translasjon er en prosess som skaper merkede DNA-prober for ulike hybridiseringsreaksjoner, mens endefylling er en teknikk som lager stumpe fragmenter ved å legge til nukleotider i enkelttrådete overheng.
Nick-oversettelse og endefylling er to teknikker som brukes i molekylærbiologi. Nick-translasjon brukes til å merke prober for hybridisering for å påvise spesifikke nukleotidsekvenser. Endefylling brukes til å lage stumpe fragmenter som hadde klebrige ender med enkelttrådede overheng. Begge teknikkene har stor betydning, og de utføres rutinemessig i molekylære forskningslaboratorier.
Hva er Nick Translation?
Nick-translasjon er en viktig teknikk som brukes til å forberede merkede prober for ulike molekylærbiologiske teknikker som blotting, in situ hybridisering, fluorescerende in situ hybridisering, etc. Det er en in vitro metode for DNA-merking. DNA-prober brukes til å identifisere spesifikke DNA- eller RNA-sekvenser. Ved hjelp av en merket probe kan spesifikke fragmenter merkes eller visualiseres fra en kompleks blanding av nukleinsyre. Derfor fremstilles merkede prober ved bruk av forskjellige teknikker. Nick-oversettelse er en slik metode som produserer merkede prober ved hjelp av DNase 1- og DNA-polymerase 1-enzymer.
Figur 01: Nick Translation
Nick-oversettelsesprosessen starter med DNase 1-enzymaktivitet. DNase 1 introduserer hakk til fosfatryggraden til dobbelttrådet DNA ved å sp alte fosfodiesterbindinger mellom nukleotider. Når nicket er opprettet, vil fri 3′ OH-gruppe av nukleotidet bli produsert, og DNA-polymerase 1-enzym vil virke på den. 5′ til 3′ eksonukleaseaktivitet til DNA-polymerase 1 fjerner nukleotider fra hakket mot 3′-retningen til DNA-tråden.
Samtidig virker polymeraseaktiviteten til DNA-polymerase 1-enzymet og legger til nukleotider for å erstatte de fjernede nukleotidene. Hvis nukleotidene er merket, vil erstatningen skje med de merkede nukleotidene, og det vil merke DNA for identifikasjon. Til slutt kan dette nylig syntetiserte merkede DNAet brukes som prober i forskjellige hybridiseringsreaksjoner.
Hva er sluttfylling?
Endefylling er en teknikk som brukes i molekylærbiologi for å lage stumpe fragmenter. Restriksjonsfordøyelse produserer fragmenter med overheng. Disse fragmentene er kanskje ikke kompatible for å ligere inn i plasmidvektorer. Vektorer er ofte sløvet for å tillate at ikke-kompatible ender kan slås sammen. Derfor kan fragmenter med overheng gjøres stumpe ved å legge nukleotidene til den komplementære tråden ved å bruke overhenget som mal for polymerisering. Denne prosessen er kjent som sluttfylling.
DNA-polymeraser som Klenow-fragment av DNA-polymerase I og T4 DNA-polymerase katalyserer endefyllingen. De legger til nukleotider for å fylle ut (5′ → 3′) og tygge tilbake (3′ → 5′). Når de klebrige endene er fylt, blir de sløve, og de er klare til å binde seg til en vektor.
I tillegg kan endefylling brukes til å merke DNA-molekyler. Den kan imidlertid bare brukes til å merke DNA-molekyler med klebrige ender. Sammenlignet med nick-oversettelse er endefylling en skånsommere metode som sjelden forårsaker DNA-brudd.
Hva er likhetene mellom Nick-oversettelse og sluttfylling?
- Både nick-oversettelse og endefylling er molekylærbiologiske teknikker.
- De kan brukes til å merke prober.
- Begge er in vitro
Hva er forskjellen mellom Nick-oversettelse og sluttfylling?
Nick-oversettelse er en teknikk som lager merkede prober for hybridisering. I kontrast er endefylling en teknikk som lager stumpe fragmenter for ligering inn i vektorer. Så dette er nøkkelforskjellen mellom nick-oversettelse og sluttfylling. Videre krever Nick-oversettelse bruk av 5'til 3'-eksonukleaseaktivitet, mens sluttfylling ikke krever 5'til 3'-eksonukleaseaktivitet.
Infografikken nedenfor viser forskjellene mellom nick-oversettelse og sluttfylling mer detaljert.
Summary – Nick Translation vs End Fylling
Nick-oversettelse er en metode som inkorporerer radiomerkede nukleotider i DNA. Den syntetiserer merkede prober basert på aktivitetene til DNase 1 og E. coli DNA polymerase 1 enzymer. Endefylling er derimot en teknikk som produserer stumpe fragmenter. Når fragmentene har klebrige ender (enkeltrådede overheng), er det nødvendig å gjøre dem stumpe ender for å ligere til vektorer. Endefylling legger til kompatible nukleotider og lager stumpe endefragmenter for å gjøre dem kompatible for ligering. Dermed oppsummerer dette forskjellen mellom nick-oversettelse og sluttfylling.
