Key Difference – Nick Translation vs Primer Extension
Nick-oversettelse og primerforlengelse er to viktige teknikker som utføres i molekylærbiologi. Nøkkelforskjellen mellom nick-translasjon og primer-forlengelse er at nick-translasjonsprosessen produserer merkede prober for andre hybridiseringsteknikker, mens primer-forlengelsesmetoden identifiserer en spesifikk RNA-sekvens fra en blanding og avslører informasjon om uttrykket av mRNA. Begge teknikkene har stor betydning og utføres rutinemessig i molekylære forskningslaboratorier.
Hva er Nick Translation?
Nick-oversettelse er en viktig teknikk som brukes til å forberede merkede prober for ulike molekylærbiologiske teknikker som blotting, in situ hybridisering, fluorescerende in situ hybridisering etc. Det er en in vitro-metode for DNA-merking. DNA-prober brukes til å identifisere spesifikke DNA- eller RNA-sekvenser. Ved hjelp av en merket probe kan spesifikke fragmenter merkes eller visualiseres fra en kompleks blanding av nukleinsyre. Derfor fremstilles merkede prober ved å bruke forskjellige teknikker som skal brukes til forskjellige teknikker. Nick-oversettelse er en slik metode som produserer merkede prober ved hjelp av DNase 1- og DNA-polymerase 1-enzymer.
Nekke-oversettelsesprosessen starter med DNase 1-enzymaktivitet. DNase 1 introduserer hakk i fosfatryggraden til dobbelttrådet DNA ved å sp alte fosfodiesterbindinger mellom nukleotider. Når nicket er opprettet, vil fri 3' OH-gruppe av nukleotidet bli gitt og DNA-polymerase 1-enzym vil virke på den. 5' til 3' eksonukleaseaktivitet til DNA-polymerase 1 fjerner nukleotider fra hakket mot 3'-retningen til DNA-tråden. Samtidig virker polymeraseaktiviteten til DNA-polymerase 1-enzymet og legger til nukleotider for å erstatte de fjernede nukleotidene. Hvis nukleotidene var merket, vil erstatningen skje med de merkede nukleotidene og det vil merke DNA for identifikasjon. Dette nylig syntetiserte merkede DNA-et kan brukes som prober i ulike hybridiseringsreaksjoner i molekylærbiologi.
Figur 01: Nick-oversettelsesprosess
Hva er Primer Extension?
Primer extension er en teknikk som brukes til å finne spesifikk RNA-sekvens fra en RNA-blanding og lokalisere 5'-enden av mRNA-transkriptet. Det brukes også til å studere strukturen til RNA og uttrykk. Primerforlengelsesmetoden utføres med merkede primere eller med merkede nukleotider. Hvis merkede primere brukes, utelukker det behovet for merking av nukleotidene som brukes til syntese av cDNA. Det er flere trinn i denne teknikken. Det starter med ekstraksjon av RNA fra prøven. Deretter tilsettes en merket oligonukleotidprimer til blandingen sammen med de nødvendige ingrediensene for å syntetisere cDNA av en spesifikk RNA-sekvens. Primer annealer med den komplementære sekvensen fra blandingen. Ved å bruke den primer-annealede sekvensen som mal, syntetiserer enzymet revers transkriptase det komplementære DNA (cDNA) til RNA-sekvensen. Primer-annealing og revers transkripsjon skjer bare når den spesifikke RNA-sekvensen er tilstede i prøven. Til slutt, når denaturerende gelelektroforese utføres, kan størrelsen på RNA-sekvensen bestemmes. Det er også lett å finne +1-basen til mRNA-sekvensen (transkripsjonsinitieringssted) ved hjelp av primerforlengelsesmetoden. Mengden mRNA som er tilstede i prøven kan kvantifiseres med denne metoden hvis overflødig primer brukes.
Figur 02: Primer-utvidelse
Hva er forskjellen mellom Nick Translation og Primer Extension?
Nick Translation vs Primer Extension |
|
| Nick-oversettelse er en prosess som lager merkede DNA-prober for ulike hybridiseringsreaksjoner. | Primer-forlengelse er en teknikk som brukes til å finne spesifikt RNA eller for å studere genuttrykk. |
| Enzymes Used | |
| DNase 1 og DNA-polymerase-enzymer brukes. | Revers transkriptase-enzym brukes. |
| Betydning | |
| Nick-oversettelse letter merkingen av spesifikk DNA-sekvens. | Primer-forlengelse muliggjør deteksjon av spesifikk mRNA-sekvensstørrelse og mengden som er tilstede i prøven. |
Sammendrag – Nick Translation vs Primer Extension
Nick translation er en metode som brukes til å syntetisere merkede prober basert på aktivitetene til DNase 1 og E coli DNA polymerase 1 enzymer. Det er en in vitro-metode som brukes i laboratoriene før forskjellige hybridiseringsteknikker. Under nick-translasjonen fjerner 5'-3' eksonukleaseaktiviteten til DNA-polymerase 1 nukleotider foran nicket og polymeraseaktiviteten til DNA-polymerase 1 erstatter de fjernede nukleotidene med merkede nukleotider bak nicket. Primer-forlengelse er en metode som brukes til å oppdage et spesifikt RNA-transkript fra en blanding og kvantifisere størrelsen og mengden av interesse-RNA. Dette er forskjellen mellom nick-oversettelse og primer-forlengelse.
