Nøkkelforskjell – AFLP vs RFLP
DNA-studier har en enorm betydning for å forstå og bestemme fylogenetiske forhold, diagnostisere genetiske sykdommer og kartlegge organismers genomer. Flere teknikker assosiert med DNA-analyse brukes også for identifikasjon av et bestemt gen eller en DNA-sekvens i en pool av ukjent DNA. De er kjent som molekylære markører. Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) og Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) er to slike molekylære markører (metoder) utviklet i molekylærbiologi for å oppdage genetisk variasjon mellom organismer. Begge metodene er like viktige og har fordeler og ulemper. Hovedforskjellen mellom AFLP og RFLP er at AFLP involverer selektiv PCR-amplifisering av det fordøyde DNAet, mens RFLP ikke involverer selektiv PCR-amplifisering av DNA-fragmentene.
Hva er AFLP?
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) er et viktig verktøy innen molekylærbiologi og er mye brukt i genetisk variasjonsanalyse. AFLP er basert på den spesifikke PCR-amplifiseringen av det fragmenterte genomiske DNAet og påvisning av polymorfismen ved autoradiografer via gelelektroforese. AFLP bidrar i stor grad til å identifisere genetiske forskjeller i stammer eller nært beslektede arter fra forskjellige riker, inkludert planter, dyr, bakterier og sopp. AFLP kan utføres med små mengder ukjente DNA-prøver. Det krever ikke forutgående sekvenskunnskap og utforming av sonder.
Trinn til AFLP
- Isolering av DNA
- Fordøyelse av DNA med restriksjonsendonukleaser
- Ligering av de begrensede DNA-fragmentene med adaptere
- Selektiv amplifikasjon av fragmentene med spesifikke restriksjonssteder
- Separasjon av PCR-produktene ved gelelektroforese
- Visualisering av gelmatrisen med autoradiograf
AFLP er en mer sensitiv og reproduserbar metode som kan brukes i DNA-profilering av flere taxa inkludert sopp, bakterier, planter og dyr uten forkunnskaper om DNA-sekvenser. Det hjelper med å identifisere små forskjeller mellom individer i populasjoner på grunn av dens svært sensitive natur. AFLP er også viktig i genomkartlegging, rettsmedisinske studier, foreldretesting, genotyping osv.
Figur 01: AFLP
Hva er RFLP?
Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLPs) er en teknikk som brukes til å oppdage genetiske variasjoner i homologe DNA-sekvenser. Det er den første metoden utviklet for DNA-profilering. Organismer har unike DNA-fingeravtrykk eller DNA-profiler. RFLP fungerer som et viktig verktøy for å analysere variasjonen mellom DNA-profiler til intraspesifikke eller nært beslektede organismer siden homologe sekvenser har forskjellige restriksjonssteder (plasseringer) som er unike for en bestemt organisme. Når homologt DNA fordøyes med spesifikke restriksjonsendonukleaser, vil det resultere i forskjellige DNA-profiler som er unike for hvert individ. Derfor er prinsippet for denne metoden påvisning av genetisk variasjon blant organismer ved å begrense homologt DNA med spesifikke restriksjonsenzymer og analyse av fragmentlengdepolymorfismen via gelelektroforese og blotting. Blottingmønstre er unike for hver organisme og karakteriserer de spesifikke genotypene.
Trinn til RFLP
- Isolering av tilstrekkelig mengde DNA fra prøver
- Fragmentering av DNA-prøvene med spesifikke restriksjonsendonukleaser til kort sekvens
- Separering av de resulterende fragmentene med forskjellige lengder ved agarosegelelektroforese.
- Overføring av gelprofilen til en membran ved hjelp av Southern blotting
- Hybridisering av membranen med merkede prober og analyse av fragmentlengdepolymorfismen i hver profil
RFLP er en svært viktig teknikk for å oppdage sykdomsarv og finne risikoen for at sykdommen oppstår blant familiemedlemmer. RFLP brukes også ofte i genomkartlegging, identifisering av kriminelle i rettsmedisin, farskapstesting osv. RFLP har også flere begrensninger. RFLP krever forkunnskaper om sekvensdata for å designe prober for hybridisering. Det krever også isolering av tilstrekkelig mengde DNA fra prøven for å analysere, noe som er vanskelig i rettsmedisinske studier.
Figur 01: RRFLP-kartlegging
Hva er forskjellen mellom AFLP og RFLP?
ALFP vs RFLP |
|
| AFLP involverer selektiv PCR-amplifisering av det fordøyde DNA. | RFLP involverer ikke PCR med mindre det er PCR-RFLP. |
| Sequence Knowledge | |
| Forhåndskunnskap om sekvens er ikke nødvendig. | Forutgående sekvenskunnskap er nødvendig for utformede RFLP-sonder. |
| Reliability | |
| Dette er mer pålitelig. | Dette er mindre pålitelig sammenlignet med AFLP. |
| Effektivitet i å oppdage polymorfisme | |
| Dette har en høyere effektivitet i å oppdage polymorfi enn RFLP. | Dette er mindre effektivt sammenlignet med AFLP. |
| Kostnad | |
| Dette er litt dyrt sammenlignet med RFLP. | Dette er rimeligere sammenlignet med AFLP. |
| Applications | |
| AFLP-er har blitt brukt på genomkartlegging, DNA-fingeravtrykk, studier av genetisk mangfold, farskapstesting og rettsmedisin | RFLP-analyse er et viktig verktøy i genomkartlegging, lokalisering av gener for genetiske lidelser, bestemmelse av risiko for sykdom og farskapstesting. |
Sammendrag – AFLP vs RFLP
AFLP og RFLP er to teknikker som brukes som genetiske markører for evaluering av mangfold og vurdering av genetiske sammenhenger i molekylærbiologi. AFLP fungerer som en effektiv og sensitiv metode for påvisning av genetisk polymorfisme mellom organismer enn RFLP. Men selv om begge disse metodene har forskjellig effektivitet når det gjelder å oppdage genetiske variasjoner, brukes de fortsatt til DNA-fingeravtrykk og sykdomsdiagnose.
