Nøkkelforskjell – RAPD vs RFLP
Genetiske markører brukes i molekylærbiologi for å identifisere genetiske variasjoner mellom individer og arter. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) og Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) er to viktige molekylære markører som rutinemessig brukes i laboratorier. RAPD utføres med korte og vilkårlige oligonukleotidprimere, og den er basert på tilfeldig amplifikasjon av de flere lokasjonene gjennom mal-DNA til organismen. RFLP utføres med en spesifikk restriksjonsendonuklease, og den er basert på polymorfismen til resulterende restriksjonsfragmenter og hybridisering. Hovedforskjellen mellom RAPL og RFLP er at RAPD er en type PCR-teknikk utført uten forutgående sekvenskunnskap, mens RFLP ikke er involvert i PCR og krever forutgående sekvenskunnskap for å utføre teknikken.
Hva er RAPD?
RAPD er en nyttig molekylær markør innen molekylærbiologi. Det er en rask og enkel teknikk. RAPD kan defineres som en metode som resulterer i polymorfe DNA-sekvenser som et resultat av tilfeldig amplifikasjon av flere steder av mål-DNA-malen. RAPD bruker korte oligonukleotidprimere med vilkårlige sekvenser for PCR-amplifikasjonen. Primere syntetiseres kunstig uten forutgående sekvenskunnskap. Derfor anses det som en enkel og nyttig teknikk.
De følgende hovedtrinnene er involvert i RAPD.
- ekstrahering av mål-DNA
- Amplifikasjon av de flere plasseringene til mål-DNA ved bruk av tilfeldig valgte primere
- Gelelektroforese av de forsterkede PCR-produktene
- Farging med etidiumbromid og identifisering av polymorfismen
Som et resultat av variasjonen i primer-annealingen, genereres forskjellige fragmenter med forskjellig lengde under amplifikasjonen. Derfor er båndmønstre på gelene forskjellige mellom individer og arter. Dermed muliggjør RAPD påvisning av genetisk variasjon mellom organismer i identifikasjon og differensiering.
RAPD brukes i ulike studier av molekylærbiologi som identifikasjon av den genetiske forskjellen mellom nært beslektede arter, genkartlegging, DNA-fingeravtrykk, identifikasjon av arvelige sykdommer, etc.
Figur 01: RAPD
Hva er RFLP?
Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLPs) er en molekylær markør som brukes i molekylærbiologi for identifisering av genetisk variasjon i homologe DNA-sekvenser. Det er den første genetiske markøren utviklet for DNA-fingeravtrykk. Alle organismer produserer unike DNA-profiler når de begrenses med spesifikke restriksjonsenzymer. RFLP fungerer som et viktig verktøy for å produsere unike DNA-profiler av individer og påvisning av genetisk variasjon blant dem. Når DNA-prøver fordøyes med spesifikke restriksjonsendonukleaser, gir det forskjellige DNA-profiler som er unike for hvert individ. Derfor er prinsippet for denne metoden påvisning av genetisk variasjon blant organismer ved å begrense homologt DNA med spesifikke restriksjonsenzymer og analyse av fragmentlengdepolymorfismen via gelelektroforese og blotting. Blottingmønstre er unike for hver organisme og karakteriserer de spesifikke genotypene.
Følgende trinn er involvert i RFLP.
- Isolering av tilstrekkelig mengde DNA fra prøver
- Fragmentering av DNA-prøvene med spesifikke restriksjonsendonukleaser til kort sekvens
- Separering av de resulterende fragmentene med forskjellige lengder ved agarosegelelektroforese.
- Overføring av gelprofilen til en membran ved hjelp av Southern blotting
- Hybridisering av membranen med merkede prober og analyse av fragmentlengdepolymorfismen i hver profil
RFLP har ulike applikasjoner som diagnostisering av arvesykdommer, genomkartlegging, kriminell identifisering i rettsmedisinske studier, farskapstesting, etc.
Figur 02: RFLP-genotyping
Hva er forskjellen mellom RAPD og RFLP?
RAPD vs RFLP |
|
| RAPD er en molekylær markør basert på tilfeldige primere og PCR. | RFLP er en molekylær markør basert på produksjon av restriksjonsfragmenter med forskjellige lengder. |
| Required Sample | |
| Små DNA-prøver er nok for RAPD-analysen. | En stor mengde ekstrahert DNA-prøve er nødvendig for RFLP-analyse. |
| Time | |
| RAPD er en rask prosess. | RFLP er en tidkrevende prosess. |
| Primer Use | |
| Tilfeldige primere brukes og samme primere kan brukes for forskjellige arter. | Artsspesifikke prober brukes i RFLP for hybridisering. |
| Reliability | |
| Teknikkens pålitelighet er mindre sammenlignet med RFLP. | RFLP er en pålitelig teknikk. |
| Blotting | |
| RAPD involverer southern blotting. | Southern blotting er ett trinn i RFLP. |
| Deteksjon av allelisk variasjon | |
| Alleliske variasjoner kan ikke oppdages av RAPD. | Alleliske variasjoner kan oppdages av RFLP. |
| Need for Sequence Knowledge | |
| RAPD krever ikke forutgående sekvenskunnskap. | Forutgående sekvenskunnskap er nødvendig for probedesign. |
| PCR | |
| PCR er involvert i RAPD | PCR er ikke involvert i RFLP. |
| Reproduserbarhet | |
| RAPD har lav reproduserbarhet | RFLP har høy reproduserbarhet sammenlignet med RAPD. |
Sammendrag – RAPD vs RFLP
RAPD og RFLP er viktige markører som brukes i molekylærbiologi. Begge metodene er i stand til å oppdage genetisk variasjon mellom organismer. RAPD utføres ved hjelp av tilfeldige primere. RFLP utføres ved bruk av spesifikke restriksjonsenzymer. Begge metodene produserer DNA-profiler unike for individuelle organismer. RAPD er involvert relativt få trinn enn RFLP. Men det gir mindre pålitelige og reproduserbare resultater enn RFLP. Dette er hovedforskjellen mellom RAPD og RFLP.
