Nøkkelforskjell – Nitrocellulose vs PVDF
Western blotting er en metode som tillater deteksjon og kvantifisering av spesifikke proteiner fra en proteinprøve. Påliteligheten til teknikken avhenger av valget av en riktig membran for absorpsjon av proteiner fra gelen. Det finnes forskjellige typer mikroporøse membraner. Nitrocellulose- og PVDF-membraner er to slike membraner foretrukket av forskerne på grunn av deres spesielle egenskaper fremfor andre typer membraner. Valget mellom nitrocellulose eller PVDF er også en annen utfordring i western blotting. Både nitrocellulose og PVDF har høy proteinabsorpsjonskapasitet. Den viktigste forskjellen mellom nitrocellulose og PVDF-membran er at nitrocellulosemembraner ikke har evnen til å fjerne antistoffer og gjenbruke membranen for antistoff-reprobing mens PVDF-membraner har stripping- og gjenbruksevne.
Hva er nitrocellulose?
Nitrocellulose er en polymer produsert ved å behandle cellulose med salpetersyre og brukes til å lage mikroporøse membraner i molekylærbiologi, spesielt for blotting-teknikker som southern, northern og western blotting. Porestørrelser på nitrocellulosemembraner varierer fra 3 til 20 µm. Nitrocellulose mikroporøse membraner letter påvisningen av immunkjemisk reaksjon som skjer på overflaten av membranen. Derfor brukes nitrocellulosemembraner ofte for immobilisering av proteiner og påvisning av spesifikke proteiner i western blotting. Nitrocellulosemembraner kan også immobilisere glykoproteiner og nukleinsyrer.
Nitrocellulosemembraner foretrekkes i lateral flow-analyser på grunn av flere funksjoner. Nitrocellulosemembraner absorberer proteiner i høy konsentrasjon. Løsemidlet som brukes til å fukte membranen, reduserer ikke absorpsjonen av nitrocellulosemembranprotein. Nitrocellulosemembraner kan enkelt kuttes til ønsket gelstørrelse og overføre proteiner fra gelen til membranen ved elektrisk eller kapillær overføring. Nitrocellulose tillater raskere flyt av proteiner gjennom membranen med høyt bindingspotensial. Nitrocellulose viser en forbedret håndteringsstyrke. En annen spesiell egenskap ved nitrocellulosemembranen er at den enkelt kan limes med vannbestandig lim uten løsemidler på forskjellige plastunderlag.
Figur 01: Nitrocellulosemembran for western blotting
Hva er PVDF?
Polyvinylidendifluorid (PVDF) er fluorpolymer produsert ved polymerisering av vinylidendifluorid og har høy immobiliseringsevne av proteiner. Derfor brukes mikroporøse membraner laget av PVDF i western blotting-teknikker for å analysere spesifikke proteiner fra blandingene av proteiner. PVDF-membraner kan også brukes til aminosyreanalyse og proteinsekvensering. Den viktigste egenskapen til PVDF-membran fremfor nitrocellulosemembran er at den enkelt kan fjernes fra antistoffene og gjenbrukes for påfølgende antistoffprober.
PVDF-membraner er tykkere enn nitrocellulosemembraner; dermed mer motstandsdyktig mot skader under gjenbruk. PVDF-membraner er svært hydrofobe. Derfor må de bløtlegges i metanol eller isopropanol før bruk.
Hva er forskjellen mellom nitrocellulose og PVDF?
Nitrocellulose vs PVDF |
|
| Nitrocellulose er en polymer sammensatt av cellulose. | PVDF er en fluorpolymer produsert ved polymerisering av vinylidendifluorid. |
| Membranporestørrelse | |
| Typiske porestørrelser er 0,1, 0,2 eller 0,45μ | Typiske porestørrelser er 0,1, 0,2 eller 0,45μm |
| Proteinbindingskapasitet | |
| Nitrocellulose har en proteinbindingskapasitet på 80 til 100 μg/cm2. | PVDF har en proteinbindingskapasitet på 170 til 200 μg/cm2. |
| Sensitivitet | |
| Dette har lav følsomhet sammenlignet med PVDF. | Dette har høy følsomhet. |
| Deteksjon av lavt uttrykte proteiner | |
| Siden følsomheten er lav i nitrocellulosemembraner, er den ikke egnet for påvisning av lavt uttrykte proteiner. | Dette er mer egnet for påvisning av lavt uttrykte proteiner på grunn av dets høye følsomhet. |
| Bakgrunnsstøy | |
| Dette har lavere bakgrunnsstøy | Dette har høyere bakgrunnsstøy. |
| Interaksjoner med proteiner | |
| Proteinmolekyler binder seg til nitrocellulosemembraner gjennom hydrofobe interaksjoner. | Proteiner binder seg til PVDF-membraner gjennom hydrofobe og dipolinteraksjoner. |
| Nature of the Membrane | |
| Nitrocellulose er sprø og skjør. Versjoner av nitrocellulose er imidlertid tilgjengelige, og de er motstandsdyktige. | PVDF er mer holdbar og har høyere kjemisk motstand. |
| Mulighet til å strippe og gjenbruk | |
| Nitrocellulose kan ha problemer med å strippe og prøve uten å miste signalet. | PVDF er ideell for reprobing og sekvensering av applikasjoner. |
| egnethet | |
| Nitrocellulose er ideell for å oppdage proteiner med lav molekylvekt. | PVDF er mer egnet for å oppdage proteiner med høyere molekylvekt. |
| Annen bruk | |
| Nitrocellulose kan brukes til nukleinsyreanalyse og dot/slot blotting. | PVDF kan brukes til proteinsekvensering og fastfaseanalysesystemer. |
| Kostnad | |
| Dette er billigere enn PVDF-membraner. | Dette er dyrere enn nitrocellulosemembraner. |
| Need for Pre-wetting | |
| Nitrocellulosemembraner krever ikke forhåndsblødning med metanol | PVDF-membraner krever forhåndsblødning med metanol. |
Sammendrag – Nitrocellulose vs PVDF
Nitrocellulosemembraner var de første membranene som ble brukt kommersielt for lateral flow-analyse. De har høy kapasitet til å absorbere proteiner. Derfor brukes nitrocellulosemembraner i western blotting. PVDF er en annen type membran som brukes i western blotting, og den har også høy proteinabsorpsjonskapasitet. Begge typer brukes i western blotting for proteinanalyse. Imidlertid har PVDF-membraner mer spesielle egenskaper, noe som gjør dem mer egnet enn nitrocellulosemembraner for western blotting. Men nitrocellulosemembraner er mer egnet for å påvise lavmolekylære proteiner, PVDF-membraner er mer egnet for å påvise høymolekylære proteiner. Dette er forskjellen mellom nitrocellulose- og PVDF-membraner.
