Nøkkelforskjell – varm vs kald trypsinisering
Varm og kald trypsinisering er to metoder som brukes i enzymatisk disaggregering av celler i dyrecelledyrking. Nøkkelforskjellen mellom varm og kald trypsinisering, som navnene antyder, avhenger av temperaturen som trypsinet tilsettes ved for cellulær disaggregering. Varm trypsinisering finner sted under høyere temperaturforhold (36,5 – 37 0C), mens kald trypsinisering finner sted under forhold med lav temperatur.
Under prosessen med primær celledyrking av dyreceller er det tre hovedmetoder som er brukt og har vist seg å være vellykkede. De tre metodene inkluderer mekanisk disaggregering av celler, enzymatisk disaggregering av celler og den primære eksplantasjonsteknikken. Enzymatisk disaggregering av celler som fører til isolering av celler, og det gjøres av det proteinnedbrytende enzymet trypsin. Derfor er denne prosessen kjent som trypsinisering. Trypsinisering kan gjøres under to forskjellige forhold, nemlig varm trypsinisering og kald trypsinisering. Varm trypsinisering er metoden for å behandle cellene med trypsin under varme forhold ved en temperatur på 36,5 – 37 0C. Kald trypsinisering er prosessen med trypsinbehandling som foregår under kaldere forhold, fortrinnsvis i is som opprettholder svært lave temperaturer.
Hva er varm trypsinisering?
Trypsinisering kan gjøres for å disaggregere de cellulære komponentene for å isolere cellene for å produsere en primær cellekultur. Trypsin er et proteinnedbrytningsenzym, og enzymblandingen som brukes i trypsinisering kan enten være et råekstrakt eller et renset produkt. Råekstraktet sies å være mer effektivt i proteinlyse og celleoppløsning siden det inneholder andre nedbrytende enzymer.
Varm trypsinisering er den mest brukte enzymatiske metoden for celledisaggregering som finner sted under høyere temperaturforhold. Før behandlingen med trypsinering kuttes ønsket vev i mindre biter. Det letter den enkle oppdelingsprosessen. Det oppkuttede vevet vaskes deretter i et spesielt medium kjent som Dissection Basal S alt medium.
Etter at vasketrinnet er fullført, transformeres cellene til en kolbe som inneholder det aktive enzymet, som er trypsin. Siden denne teknikken innebærer en varm trypsiniseringsprotokoll, plasseres trypsinet ved en temperatur på rundt 37 0C i omtrent fire timer.
Figur 01: Trypsin
Innholdet blandes og omrøres ved å bruke sentrifugeringsmetoder for å lette protokollen og for å øke hastigheten på disaggregeringsprosessen. Når den anbef alte tiden er oppnådd, kan cellene utledes fra supernatanten. Cellene avledet fra supernatanten inkuberes deretter ved en bestemt temperatur og tid.
Hva er kald trypsinisering?
Kald trypsinisering er den andre typen trypsinisering som finner sted under kalde forhold. I denne teknikken blir cellene som er hakket og vasket plassert i hetteglass på is og deretter dynket med trypsin. Bløtleggingsperioden er mye lengre – ca. 6 – 24 timer.
Etter fullføring av bløtleggingsprosedyren fjernes trypsinet fra cellelysatet, og vevsstykkene inkuberes videre ved 37 0C i ca. 20 – 30 minutter. Oppløsningen av cellene skjer ved gjentatt pipettering av vevsblandingen. Dette vil tillate cellene å dissosiere fra membranen og komme til supernatanten. Når cellene er i supernatanten, inkuberes de og dyrkes ved ønsket temperatur og tidsperiode.
Den kalde trypsiniseringsmetoden har flere fordeler
- Høyere utbytte av levedyktige celler ettersom celleskaden minimeres. Celleskaden minimeres ved å ikke bruke sentrifugeringstrinn.
- Svært praktisk metode.
- Mindre arbeidskrevende.
Den største begrensningen ved kald trypsiniseringsmetoden er at store mengder ikke kan brukes i ett tilfelle.
Hva er likhetene mellom varm og kald trypsinisering?
- Både varm og kald trypsiniseringsprosesser bruker enzymet trypsin for disaggregering av celler.
- Både varm og kald trypsiniseringsprosesser brukes i cellekulturprosedyrer for oppdeling av celler.
- I både varm og kald trypsiniseringsprosedyrer er cellene avledet fra supernatanten.
Hva er forskjellen mellom varm og kald trypsinisering?
Varm vs. Kald Trypsinisering |
|
| Varm trypsinisering er metoden for å behandle cellene med trypsin under varme forhold ved en temperatur på 36,5 – 37 0. | Kaldtrypsinisering er prosessen med trypsinbehandling som foregår under kaldere forhold, fortrinnsvis i is som opprettholder svært lave temperaturer. |
| Protocol | |
| De oppkuttede vevsbitene holdes på 37 0C kontinuerlig gjennom hele prosedyren. | De oppkuttede vevsbitene holdes først ved iskalde temperaturer og deretter ved 37 0. |
| Temperature | |
| Varm trypsinisering skjer ved 36,5 – 37 0 | Kald trypsinisering skjer ved iskalde temperaturer. |
| Tidsbruk | |
| Mindre tid kreves for hele prosessen (rundt 4 timer) med varm trypsinisering. | Lengre tid kreves (rundt 6 – 24 timer) for kald trypsinisering. |
| Yield of Leable Cells | |
| Lavt varm trypsinisering. | Høy i kald trypsinisering. |
| Bruk av sentrifugering | |
| Sentrifugering er nødvendig for disaggregering av celler i varm trypsinisering. | Sentrifugering er ikke nødvendig ved kald trypsinisering. |
| Innledende vevsmengde for trypsinisering | |
| En større mengde vev kan brukes i varm trypsinisering. | En mindre mengde vev kan brukes ved kald trypsinisering. |
| Celleskade | |
| Høy på grunn av sentrifugering i varm trypsinisering. | Mindre på grunn av kald trypsinisering. |
sammendrag – varm vs kald trypsinisering
Trypsinisering er metoden for å bruke det proteinnedbrytende enzymet trypsin for disaggregering og fremstilling av primære cellekulturer under celledyrkingsprosessen. Det er to hovedteknikker for trypsinisering basert på temperaturene som brukes under prosedyren. De er varm og kald trypsinisering. Varm trypsinisering utføres ved 37 0C, mens kald trypsinisering utføres under iskalde forhold. Selv om kald trypsinisering tar lengre tid å fullføre, sies det å ha et høyere utbytte av levedyktige celler. Dette skyldes det faktum at celleskade minimeres ved kald trypsinisering da den ikke bruker kraftige sentrifugeringstrinn. Dette er forskjellen mellom varm og kald trypsinisering.
