Nøkkelforskjell – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green og Taqman er to metoder som brukes for å oppdage eller se forsterkningsprosessen for sanntids PCR. SYBR Green er en metode basert på interkalerende nukleinsyrefargingsfarge mens Taqman er en metode basert på hydrolyseprobe. Begge teknologiene er designet for å generere fluorescens under PCR, som lar sanntids PCR-maskin overvåke reaksjonen i "sanntid". SYBR Green-metoden utføres ved å bruke et fluorescerende fargestoff k alt SYBR green og detekterer amplifikasjonen ved å binde fargestoffet til produsert dobbelttrådet DNA. Taqman utføres ved bruk av dobbeltmerkede prober og detekterer amplifikasjonen ved nedbrytning av proben av Taq-polymerase og frigjøring av fluoroforen. Dette er hovedforskjellen mellom SYBR Green og Taqman.
Hva er SYBR Green?
SYBR Grønn er et fluorescerende fargestoff som brukes til å farge nukleinsyrer, spesielt dobbelttrådet DNA i molekylærbiologi. SYBR Grønn metode brukes til å kvantifisere PCR-produkter under sanntids-PCR. Når det binder seg til DNA, absorberer det resulterende DNA-fargekomplekset blått lys og sender ut intenst grønt lys. Det skjer på grunn av den strukturelle endringen som skjer i fargestoffmolekylet ved binding med dobbelttrådet DNA. Når PCR skaper mer og mer DNA, binder flere fargestoffmolekyler seg til DNA, og genererer mer fluorescens. Derfor øker fluorescensen med PCR-produktakkumuleringen. Derfor kan mengden av PCR-produkt måles kvantitativt ved hjelp av SYBR Green fluorescensdeteksjon.
SYBR grønt fargestoff kan også brukes til DNA-merking i cytometri og fluorescensmikroskopi. Etidiumbromid har blitt erstattet med SYBR Green siden etidiumbromid er et kreftfremkallende fargestoff med avhendingsproblemer under DNA-visualisering i gelelektroforesen.
Det er fordeler og ulemper med SYBR grønn metode. Denne metoden er veldig følsom, billig og enkel å bruke. Men på grunn av dens evne til å binde seg til et hvilket som helst dobbelttrådet DNA, kan uspesifikk binding føre til overkvantifisering av PCR-produkt.
Figur 01: SYBR Green Technique
Hva er Taqman?
Taqman er en alternativ metode til SYBR Green for å overvåke sanntids PCR-prosess. Denne metoden avhenger av 5'-3' eksonukleaseaktiviteten til Taq-polymerase-enzymet for å bryte ned probene under forlengelsen av den nye strengen og frigjøring av fluorofor. Dobbeltmerkede prober brukes i denne metoden, og den er basert på hydrolyse av prober. Prober er fluorescerende merkede DNA-oligonukleotider som har et fluorescerende reportermolekyl (fluorofor) i 5'-enden og et quencher-molekyl i 3'-enden. De er designet for å binde seg til den enkelttrådede malen på motsatt side av primer-annealene. Taq-polymerase legger til nukleotider til primeren og utvider den nye tråden mot de dobbeltmerkede probene. Når Taq-polymerasen møter proben, aktiverer og degraderer eksonukleasevirkningen til Taq-polymerasen proben. Når den har fullført syntesen av den nye tråden, utsettes sonden for fullstendig nedbrytning og frigjør fluoroforen. Frigjøringen av fluorofor genererer fluorescens. Fluorescerende Quencher-molekyl slukker effektivt det utsendte lyset og skaper output for kvantifisering av PCR-produktet. Frigjøringen av fluoroforer og mengden av PCR-produktene er proporsjonale. Kvantifisering kan derfor enkelt gjøres ved hjelp av Taqman-metoden.
Figur 02: Taqman-metoden
Taqman-metoden brukes i sanntids PCR, kvantifisering av genuttrykk, påvisning av genetiske polymorfismer, kvantifisering av kromosomale DNA-delesjoner, bakteriell identifikasjon, verifisering av mikroarray-analyse, SNP-genotyping etc.
Hva er forskjellen mellom SYBR green og Taqman?
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Green er basert på DNA-bindende fargestoff. | Taqman er avhengig av hybridiseringsprober og 5' til 3' eksonukleaseaktivitet til Taq-polymerase. |
| Fluorescerende merket prober | |
| Ingen fluorescerende merket prober er ikke nødvendig. | Dobbeltmerkede prober kreves. |
| Multipleks genanalyse | |
| Den kan ikke brukes for multiplekse genmål. | Den kan brukes for multiplekse genmål. |
| Kostnad | |
| Dette er rimeligere. | Dette er dyrere. |
| Spesificity | |
| Dette er mindre spesifikt og binder med et hvilket som helst dobbelttråds-DNA | Disse er svært spesifikke siden prober oppdager de spesifikke forsterkningsproduktene. |
| Effektivitet | |
| Dette er mindre effektivt. | Dette er svært effektivt. |
| Application | |
| Dette brukes i sanntids PCR, visualisering av agarosegel, DNA-merking osv. | Dette brukes i sanntids PCR, kvantifisering av genuttrykk, påvisning av genetiske polymorfismer, etc. |
Sammendrag – SYBR Green og Taqman
Taqman og SYBR green er to metoder som brukes i sanntids PCR (kvantitativ PCR). Begge metodene muliggjør kvantifisering av PCR-produktet effektivt og er avhengig av emisjonen av fluorescensen. Taqman-metoden bruker dobbeltmerkede prober for påvisning av akkumulert DNA, mens SYBR Green-metoden bruker et fluorescerende fargestoff. Begge disse metodene har også forskjellige anvendelser innen molekylærbiologi.
