Nøkkelforskjell – Microarray vs RNA-sekvensering
Transkriptom representerer hele innholdet av RNA som er tilstede i en celle, inkludert mRNA, rRNA, tRNA, nedbrutt RNA og ikke-nedbrutt RNA. Profilering av transkriptom er en viktig prosess for å forstå celleinnsikten. Det finnes flere avanserte metoder for transkriptomprofilering. Microarray og RNA-sekvensering er to typer teknologier utviklet for å analysere transkriptom. Nøkkelforskjellen mellom mikroarray og RNA-sekvensering er at mikroarray er basert på hybridiseringspotensialet til forhåndsdesignede merkede prober med mål-cDNA-sekvenser, mens RNA-sekvensering er basert på direkte sekvensering av cDNA-tråder ved avanserte sekvenseringsteknikker som NGS. Microarray utføres med forkunnskapen om sekvensene og RNA-sekvensering utføres uten forkunnskapen om sekvenser.
Hva er Microarray?
Microarray er en robust, pålitelig og høy gjennomstrømningsmetode som brukes til transkriptomprofilering av forskere. Det er den mest populære tilnærmingen for transkripsjonsanalyse. Det er en rimelig metode, som avhenger av hybridiseringsprobene.
Teknikken starter med ekstraksjon av mRNA fra prøven og konstruksjon av cDNA-bibliotek fra tot alt RNA. Deretter blandes det med fluorescerende merkede forhåndsdesignede prober på en fast overflate (punktmatrise). Komplementære sekvenser hybridiserer med de merkede probene i mikroarrayen. Deretter vaskes og skjermes mikroarray, og bildet kvantifiseres. Innsamlede data bør analyseres for å få de relative uttrykksprofilene.
Intensiteten til mikroarray-probene antas å være proporsjonal med mengden av transkripsjoner i prøven. Imidlertid avhenger nøyaktigheten av teknikken av de utformede probene, forkunnskaper om sekvensen og affiniteten til probene for hybridisering. Derfor har mikroarray-teknologi begrensninger. Mikroarray-teknikk kan ikke utføres med transkripsjoner med lav overflod. Den klarer ikke å differensiere isoformer og identifisere genetiske varianter. Siden denne metoden avhenger av hybridisering av prober, oppstår noen problemer knyttet til hybridisering som krysshybridisering, uspesifikk hybridisering etc. i mikroarray-teknikk.
Figur 01: Microarray
Hva er RNA-sekvensering?
RNA-haglesekvensering (RNA-seq) er en nylig utviklet hel transkriptomsekvenseringsteknikk. Det er en rask og høy gjennomstrømningsmetode for transkriptomprofilering. Det kvantifiserer direkte uttrykket av gener og resulterer i dyp undersøkelse av transkriptomet. RNA-sekvens er ikke avhengig av forhåndsdesignede prober eller forkunnskap om sekvensene. Derfor har RNA-seq-metoden høy følsomhet og evne til å oppdage nye gener og genetiske varianter.
RNA-sekvenseringsmetode utføres via flere trinn. Tot alt RNA i cellen må isoleres og fragmenteres. Deretter, ved bruk av revers transkriptase, må et cDNA-bibliotek utarbeides. Hver cDNA-streng må ligeres med adaptere. Deretter må de ligerte fragmentene amplifiseres og renses. Til slutt ved bruk av en NGS-metode, må sekvensering av cDNA utføres.
Figur 02: RNA-sekvensering
Hva er forskjellen mellom Microarray- og RNA-sekvensering?
Microarray vs RNA-sekvensering |
|
| Microarray er en robust, pålitelig metode med høy gjennomstrømming. | RNA-sekvensering er en nøyaktig metode med høy gjennomstrømming. |
| Kostnad | |
| Dette er en rimelig metode. | Dette er en dyr metode. |
| Analyse av et stort antall prøver | |
| Dette gjør det lettere å analysere et stort antall prøver samtidig. | Dette gjør det lettere å analysere et stort antall prøver. |
| Dataanalyse | |
| Dataanalyse er kompleks. | Mer data genereres i denne metoden; derfor er prosessen mer kompleks. |
| Forhåndskunnskap om sekvenser | |
| Denne metoden er basert på hybridiseringsprober, så forkunnskaper om sekvenser kreves. | Denne metoden er ikke avhengig av forutgående sekvenskunnskap. |
| Strukturelle variasjoner og nye gener | |
| Denne metoden kan ikke oppdage strukturelle variasjoner og nye gener. | Denne metoden kan oppdage strukturelle variasjoner som genfusjon, alternativ spleising og nye gener. |
| Sensitivitet | |
| Dette kan ikke oppdage forskjeller i uttrykk for isoformer, så dette har begrenset følsomhet. | Dette har høy følsomhet. |
| Utfall | |
| Dette kan bare resultere i relative uttrykksnivåer. Dette gir ikke absolutt kvantifisering av genuttrykk. | Det gir absolutte og relative uttrykksnivåer. |
| Reanalyse av data | |
| Dette må kjøres på nytt for å analysere på nytt. | Sekvenseringsdata kan analyseres på nytt. |
| Behov for spesifikt personell og infrastruktur | |
| Spesifikk infrastruktur og personell er ikke nødvendig for mikroarray. | Spesifikk infrastruktur og personell som kreves av RNA-sekvensering. |
| Tekniske problemer | |
| Microarray-teknikk har tekniske problemer som krysshybridisering, uspesifikk hybridisering, begrenset deteksjonshastighet for individuelle prober osv. | RNA seq-teknikk unngår tekniske problemer som krysshybridisering, uspesifikk hybridisering, begrenset deteksjonshastighet for individuelle prober osv. |
| Biases | |
| Dette er en partisk metode siden den avhenger av hybridisering. | Bias er lav sammenlignet med mikroarray. |
Sammendrag – Microarray vs RNA-sekvensering
Microarray- og RNA-sekvenseringsmetoder er plattformer med høy gjennomstrømning utviklet for transkriptomprofilering. Begge metodene gir resultater som er sterkt korrelert til genekspresjonsprofiler. Imidlertid har RNA-sekvensering fordeler fremfor mikroarray for genekspresjonsanalyse. RNA-sekvensering er en mer sensitiv metode for påvisning av transkripsjoner med lav overflod enn mikroarray. RNA-sekvensering muliggjør også differensiering mellom isoformer og identifisering av genvarianter. Imidlertid er mikroarray det vanlige valget for de fleste forskere siden RNA-sekvensering er en ny og kostbar teknikk med datalagringsutfordringer og kompleks dataanalyse.
