Nøkkelforskjellen mellom Golden Gate og Gibson Assembly er at Golden Gate er avhengig av tilstedeværelsen av restriksjonssteder innenfor en bestemt sekvens som skal klones, mens Gibson Assembly ikke er avhengig av tilstedeværelsen av restriksjonssteder innenfor en bestemt sekvens for å bli klonet.
I løpet av de siste tiårene har molekylærforskere utviklet ulike standardiserte prosedyrer som gjør det enklere å sette sammen flere DNA-fragmenter til ett enkelt stykke. Derfor er kloningsmetoder som Restriction Enzyme Ligation, Gateway Cloning, Gibson Assembly, Golden Gate Assembly og TOPO Cloning mye brukt av forskere i vitenskapelige eksperimenter. Derfor er Golden Gate og Gibson Assembly to molekylære kloningsmetoder som gjør det mulig å sette sammen flere DNA-fragmenter til et enkelt stykke.
Hva er Golden Gate Assembly?
Golden Gate er en molekylær kloningsmetode som gjør det lettere å sette sammen flere DNA-fragmenter til et enkelt stykke. Denne metoden er avhengig av tilstedeværelsen av restriksjonsseter innenfor en bestemt sekvens som skal klones. Den oppsto i 1996. Denne teknikken bruker type IIS restriksjonsenzymer og T4 DNA-ligase. Disse enzymene kutter DNA utenfor gjenkjenningsstedene. De kan lage ikke-palindromiske overheng. Derfor kan flere fragmenter av DNA settes sammen ved bruk av kombinasjoner av overhengssekvenser.
Figur 01: Golden Gate
Golden Gate-monteringsprosedyre
Golden Gate-teknikken har tre hovedtrinn i prosedyren:
- oppretting av overheng i kloningsvektoren,
- sammenstilling av flere DNA-innsettinger ved å bruke fragmentspesifikke sekvenser i overheng, og
- ligation.
Golden Gate-montering bruker sirkulære kloningsvektorer (destinasjonsvektor). Videre, i denne metoden, elimineres restriksjonsstedet fra det ligerte produktet for å utføre fordøyelse og ligering samtidig. En typisk termisk syklusprotokoll for Golden Gate svinger mellom 37 °C og 16 °C fordi 37 °C er optim alt for restriksjonsenzymer og 16 °C er optim alt for ligaser.
Hva er Gibson Assembly?
Gibson Assembly er en molekylær kloningsmetode som gjør det mulig å sette sammen flere DNA-fragmenter til et enkelt stykke. I motsetning til Golden Gate-metoden, er ikke denne metoden avhengig av tilstedeværelsen av restriksjonsseter innenfor en bestemt sekvens som skal klones. Den ble funnet av Daniel G. Gibson fra J. Craig Venter Institute. Denne teknikken er en type sekvens- og ligase-uavhengig kloningsmetode (SLIC).
Figur 02: Gibson Assembly
Gibson monteringsprosedyre
Gibson Assembly trenger DNA-fragmenter som inneholder 20-40 basepar som overlapper med tilstøtende DNA-fragmenter. Overlapp legges til via PCR. Deretter legges disse DNA-fragmentene til Gibson-maserblandingen som har tre enzymer. Denne prosedyren utføres under isotermiske forhold (50 °C i 1 time) ved bruk av tre forskjellige enzymer: eksonuklease, DNA-polymerase og DNA-ligase. Eksonukleasen tygger tilbake DNA fra 5'-enden. Dermed hemmer det ikke polymeraseaktivitet og lar reaksjonen fortsette i en enkelt prosess. De resulterende enkelttrådede regionene på tilstøtende DNA-fragmenter kan anneales på grunn av overlappende sekvenser. DNA-polymerase fyller opp hullene ved å legge til nukleotider. Til slutt forbinder DNA-ligasen kovalent DNAet til tilstøtende segmenter. Norm alt bruker Gibson Assembly lineariserte destinasjonsvektorer. Dessuten kan denne metoden kombinere opptil 15 DNA-fragmenter samtidig basert på sekvenslikhet.
likheter mellom Golden Gate og Gibson Assembly
- Golden Gate og Gibson Assembly er to molekylære kloningsmetoder.
- Begge metodene kan sette sammen flere DNA-fragmenter til et enkelt stykke.
- Disse metodene bruker destinasjonsvektorer.
- Begge metodene bruker termiske syklere for sammenstilling av flere DNA-fragmenter.
- De brukes i stedsrettet mutagenese.
Forskjellen mellom Golden Gate og Gibson Assembly
Golden Gate er en molekylær kloningsmetode som brukes til å sette sammen flere DNA-fragmenter til et enkelt stykke som er avhengig av tilstedeværelsen av restriksjonssteder innenfor en bestemt sekvens som skal klones, mens Gibson Assembly er en molekylær kloningsmetode som brukes i sammenstilling av flere DNA-fragmenter til et enkelt stykke uten å stole på tilstedeværelsen av restriksjonsseter innenfor en bestemt sekvens som skal klones. Dette er nøkkelforskjellen mellom Golden Gate og Gibson Assembly. Dessuten bruker Golden Gate-metoden en sirkulær destinasjonsvektor, mens Gibson Assembly-metoden bruker en linearisert destinasjonsvektor.
Følgende infografikk viser forskjellen mellom Golden Gate og Gibson Assembly.
Sammendrag – Golden Gate vs Gibson Assembly
Molekylær kloning er en metode som brukes til å sette sammen rekombinante DNA-molekyler og styre deres replikasjon i vertsorganismer. Golden Gate og Gibson Assembly er to molekylære kloningsmetoder som gjør det mulig å sette sammen flere DNA-fragmenter til et enkelt stykke. Golden Gate-metoden er avhengig av tilstedeværelsen av restriksjonsseter innenfor en bestemt sekvens som skal klones, mens Gibson Assembly ikke er avhengig av tilstedeværelsen av restriksjonsseter innenfor en bestemt sekvens som skal klones. Dermed er dette hovedforskjellen mellom Golden Gate og Gibson Assembly.
