Nøkkelforskjellen mellom kromatofokusering og isoelektrisk fokusering er at kromatofokusering er en type kolonnekromatografimetode som bruker ionebytterharpikser mens isoelektrisk fokusering er en type elektroforeseteknikk som bruker immobiliserte pH-gradientgeler.
Kromatofokusering og isoelektrisk fokusering er to teknikker som skiller proteiner i henhold til deres isoelektriske punkter. Både kromatofokusering og isoelektrisk fokusering har stor oppløsningsevne. Kromatofokusering er en høyoppløselig kolonnekromatografimetode mens isoelektrisk fokusering er en elektroforetisk separasjonsmetode. Dessuten bruker ikke kromatofokusering et elektrisk felt mens isoelektrisk fokusering trenger et elektrisk felt.
Hva er kromatofokusering?
Kromatofokusering er en type høyelueringskromatografi som skiller proteiner i henhold til forskjeller i deres isoelektriske punkt. Den bruker en ionebytterharpikskolonne og en internt utviklet pH-gradient. I motsetning til isoelektrisk fokusering involverer ikke kromatofokusering et elektrisk felt. Kromatofokusering er en kraftig renseteknikk som kan løse svært like molekyler som bare skiller seg med 0,02 pH-enheter. Derfor er kromatofokusering best egnet som et siste poleringstrinn når høy oppløsning kreves for å separere svært like komponenter.
Ved kromatofokusering påføres prøven kolonnen ved å blande den med startbufferen. Proteiner som har en pH over det isoelektriske punktet er negativt ladet og de forblir nær toppen av kolonnen mens andre proteiner som har en pH under det isoelektriske punktet, migrerer nedover kolonnen. Proteinet med det høyeste isoelektriske punktet elueres først mens proteinet med det laveste isoelektriske punktet elueres sist fra kolonnen. Denne teknikken påvirkes av flere faktorer som proteinutfelling og lineariteten til pH-gradienten.
Hva er isoelektrisk fokusering?
Isoelektrisk fokusering er en teknikk som skiller forskjellige molekyler basert på deres isoelektriske punkt. Det er også kjent som elektrofokusering. Denne teknikken brukes ofte for proteinseparasjon i en gel. Ved isoelektrisk fokusering tilsettes prøven til immobiliserte pH-gradient (IPG) geler. IPG-gel er en akrylamidgelmatrise kopolymerisert med en pH-gradient. Proteinene migrerer mot katoden til de finner pH-området til deres isoelektriske punkter. Når et protein når pH som ikke har noen netto ladning, opphører migrasjonen og gir et stasjonært bånd. På samme måte gir hvert protein et bånd ved et punkt i pH-gradienten som tilsvarer dets isoelektriske punkt.
Figur 01: Isoelektrisk fokusering
Isoelektrisk fokusering er det første trinnet i todimensjonal gelelektroforese. I den teknikken separeres proteiner først i henhold til deres isoelektriske punkter ved isoelektrisk fokusering og deretter separert med molekylvekten gjennom SDS-PAGE.
Hva er likhetene mellom kromatofokusering og isoelektrisk fokusering?
- Kromatofokusering og isoelektrisk fokusering er to svært oppløselige metoder.
- Begge er basert på det isoelektriske punktet til proteiner.
- Disse teknikkene bruker en pH-gradient.
- Begge prosedyrer er informative for karakterisering av humane hemoglobinvarianter.
- De kan løse opp molekyler der pI-verdier avviker med så lite som 0,02 pH-enheter.
Hva er forskjellen mellom kromatofokusering og isoelektrisk fokusering?
Kromatofokusering er en kolonnekromatografiteknikk med høy oppløsning som skiller proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt. I motsetning til dette er isoelektrisk fokusering en elektroforetisk teknikk som skiller proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt ved påføring av et elektrisk felt langs en pH-gradient dannet i en kapillær. Så dette er hovedforskjellen mellom kromatofokusering og isoelektrisk fokusering.
En annen forskjell mellom kromatofokusering og isoelektrisk fokusering er at kromatofokusering ikke involverer et elektrisk felt mens isoelektrisk fokusering trenger et elektrisk felt.
Sammendrag – kromatofokusering vs isoelektrisk fokusering
Kromatofokusering og isoelektrisk fokusering er to lignende teknikker som har høy oppløsningsevne til molekyler, spesielt svært like molekyler. Kromatofokusering er en kolonnekromatografiteknikk med høy oppløsning mens isoelektrisk fokusering er en elektroforesemetode. Kromatofokusering involverer ikke et elektrisk felt, i motsetning til isoelektrisk fokusering. Dermed oppsummerer dette forskjellen mellom kromatofokusering og isoelektrisk fokusering.
